绿色荧光蛋白(GFP)标记杧果细菌性角斑病病原菌及其定殖规律

为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定,成功获得带绿色荧光蛋白(GFP)标记的转化子Xcm003-EGFP,采用室内刺伤和盆栽苗灌根接种试验,结合组织学观察法,追踪该病原菌在不同杧果器官组织中的定殖规律。结果表明,病原菌通过伤口侵入杧果果实果皮外层细胞层,随着侵染时间推移,向内层果皮细胞层垂直扩散并定殖,后期病原菌在伤口处大量聚集,出现隆起开裂状病斑。在杧果叶片中,病原菌从伤口侵入叶片上表皮细胞层,随后迁移到叶肉细胞间隙,侵染后期,病原菌在气孔和伤口定殖,造成气孔和伤口堵塞,导致接种点出现黑褐色水浸病斑。盆栽苗灌根后发现,该病原菌可在土壤中定殖,入侵杧果根部,但并不扩散至其他杧果组织,不会为害整株幼苗。说明杧果细菌性角斑病病菌可在不同杧果组织中定殖,但仅表现为局部侵染特性。

面向视频侦查应用的退化人像GFP深度复原技术

在视频侦查工作中时常遇到视频人像质量过低难以辨识的情况,而GFP等人像深度复原方法只适用于单张人像的复原。为此,本文提出一种基于GFP的监控视频人像复原技术,将GFP方法扩展至视频侦查应用,便于及时锁定犯罪嫌疑人,提高破案效率。首先对监控视频进行视频分帧、人像裁剪对齐、倾斜透视校正等预处理操作,然后使用GFP方法对预处理后得到的人像进行深度复原,最后经过逆处理将复原人像整合成高质量人像视频。在大量经过预处理后的模拟退化人像和无参考退化人像测试集上进行对比实验,结果表明,GFP方法在主观视觉效果和FID、PSFR、SSIM、NIQE等客观量化指标上均优于其他人像深度复原方法,相较于其他人像深度复原方法,能够更有效地复原复杂应用场景下的低质量退化人像,更适用于视频侦查应用;通过使用YTF视频人像数据集进行对比测试实验,结果显示,本文所提出的添加预处理与逆处理过程的基于GFP的监控视频人像复原技术,对于低质量视频人像有更加优秀的复原效果。

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性

将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖.

花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米

利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达.

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.

nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用

早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸,作为表达载体p1301NG的选择标记和报告基因。通过农杆菌介导法转化锦橙上胚轴,再生培养1周后用体式荧光显微镜观察外植体的再生情况。在再生培养第9天时即观察到GFP荧光再生芽的形成,再生培养后10~15 d是GFP再生芽形成的高峰期。GUS染色和PCR分子检测结果证明,GFP荧光检测结果是真实可靠的。研究结果表明：nptⅡ：：mgfp5融合基因能够在再生培养早期筛选到阳性转化芽,有助于提高阳性转化芽的存活率,提高柑橘遗传转化效率。

伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。

绿色荧光蛋白(GFP)在分子遗传学上的研究进展

作为一种新型、方便的报告基因 ,来自多管水母属的绿色荧光蛋白 (GFP)具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时 ,能够发出明亮的绿色荧光 ,且这种荧光不需要外源底物和辅因子 ,因此 ,它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和蛋白质定位 。

GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响

以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥种子的出愈量减少为野生型的59%、悬浮细胞的长短轴比缩小为1.20±0.21、第7天细胞活力下降为0.66±0.09,影响细胞的生长曲线.(2)GFP-FABD标记蛋白虽对愈伤生长影响不大,但却使悬浮细胞的长短轴比显著增加为2.49±1.18、第7天细胞的活力下降为0.87±0.06,造成悬浮细胞生长曲线的改变.(3)通过调整培养条件的激素水平,以上两种细胞骨架标记蛋白对悬浮细胞生长的影响可以得到修复.(4)检测优化条件下培养的GFP-FABD2或GFP-MBD悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力,结果未发现与野生型有明显区别.

鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究

目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR。采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量。结果荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%。结论该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量。

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.

GFP标记的球孢白僵菌在玉米中的定殖

为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接种方式在球孢白僵菌不同处理浓度下对玉米生长指标的影响。结果表明,球孢白僵菌在玉米不同组织部位上的定殖有着明显的差异,各球孢白僵菌接种处理中,均以叶部定殖的白僵菌孢子数最多,而茎部均未观测到孢子定殖;玉米根部仅在浸种和灌根处理中可见少量孢子。球孢白僵菌不同接种方式对其在玉米中定殖率的影响差异较大,灌根处理定殖率最高,为76.7%;其次为浸种处理,为73.3%;茎部注射处理及叶面喷施处理定殖率较低,分别为43.3%和36.7%。研究表明,不同施用方式及接种浓度球孢白僵菌孢悬液对玉米生长指标有一定的影响,球孢白僵菌可通过不同接种方式在玉米植株中定殖并扩散,对玉米的生长发育有一定的促进作用,其中以1×106～1×107孢子/mL球孢白僵菌孢悬液浸种或灌根,对玉米苗的促进生长作用最明显。

利用GFP和抗性双类型标记监测联合固氮菌在玉米根际的定殖

将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有抗生素抗性又在蓝光下呈现亮绿荧光的菌株 .用它们接种玉米后 ,利用这两种选择标记双重筛选重新分离到的细菌确定了接种菌在玉米幼苗根表面的定殖数目 ,同时用荧光显微镜观测了它们在玉米根表和土壤中的分布 .确证了GFP与抗生素抗性双标记定量环境中微生物的可靠性和GFP标记用于原位监测细菌分布的优越性 .图版 1图 1表 2参

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法 利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果 酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论 逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。

农杆菌介导稻瘟病菌绿色荧光蛋白(GFP)遗传转化研究

稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应用于病菌与寄主植物互作研究中。研究以p BGg Hg作为转化载体,根癌农杆菌C58C1作为转化介体,转化稻瘟病菌的强致病菌株py1022。研究发现,250μg·m L-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生长,利用根癌农杆菌介导稻瘟病菌遗传转化的最佳条件为:稻瘟病菌分生孢子浓度为1×105个·m L-1,共培养时间为4 d,共培养AS浓度为200μmol·m L-1,共培养温度为28℃。随机挑取8个转化子分别进行PCR扩增后测序、荧光显微镜下观察、致病力及稳定性测定,结果表明GFP成功转化到稻瘟病菌中,可为稻瘟病菌与水稻品种的互作机制研究提供技术支撑。

GFP基因在棉花转化中的应用

以绿色荧光蛋白GFP基因为报道基因，用花粉管通道和农杆菌介导的转化方法将外源基因导入棉花(Gossypium hirsutum L.)，分别获得转化幼胚、幼苗和转化愈伤组织。用手持紫外灯结合显微镜检术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定，比用GUS检测方法有明显的优越性。本研究不但为花粉管通道转化法的可行性提供了新的证据，同时也建立了GFP用于棉花基因工程研究的检测技术体系。

双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用

目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-I比值;单荧光GFP-LC3质粒和双荧光mRFP-e GFP-LC3质粒转染HEK293细胞,雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h,采用荧光显微镜统计,并比较两种方法转染后HEK293细胞内LC3亮点的变化。结果:不同浓度雷帕霉素处理HEK293细胞,LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加;转染GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色亮点的数量增加;转染mRFP-e GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色和红色亮点数量均增加。结论:双荧光mRFP-e GFP-LC3体系优于单荧光GFP-LC3体系,更能全面完整地反映细胞自噬水平,能够反映细胞内自噬流的变化,是自噬定量分析的可靠方法。

利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物

GFP作为报告分子被广泛地运用在转基因植株检测中。利用PCR技术扩增得到番茄Bax inhibitor-1基因(LeBI-1),亚克隆到含GFP基因的pEGFP载体上,进一步将中间载体构建到植物表达载体pBI121上。重组pBI121-LeBI-1-EGFP经农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,分化筛选后获得抗性烟草植株。利用GFP作为报告基因,采用PCRs、outhern blot及荧光方法验证外源基因LeBI-1成功转化到烟草中。分析讨论报告蛋白GFP不同检测方法的优缺点。