半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

论非法植入基因编辑、克隆胚胎罪保护法益

随着世界范围内基因编辑技术的发展,人类有了攻克遗传疾病的希望。但是“基因编辑婴儿”案的出现,使我们必须思考如何通过法律来防范基因编辑技术对人类生活的冲击。在刑法规制层面,准确把握非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益是进一步思考的前提。既往的研究将该罪法益限定为人性尊严、医疗秩序或人类遗传安全,但这并非真正的适格法益,无助于法益机能的发挥。合理界定该罪法益的方向应当是综合分析规范目的、法益性质、价值判断以及行为对象。基于以上方法,将非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益确定为人类遗传基因具有合理性。该法益界定一方面明确了“情节严重”的类型,另一方面可以作为出罪事由的判定标准,划定了犯罪行为与科研行为的界限。

单克隆抗体与Fc受体结合力检测的生物膜层干涉方法

采用生物膜层干涉技术建立了一种准确评估单克隆抗体与Fc受体结合力的方法。通过优化关键参数,包括配体固化浓度、高度、结合时间和分析物浓度,确定了最佳的实验条件:配体固化浓度为10μg/mL,固化高度控制低于0.5 nm,单克隆抗体与Fc受体结合时间为90 s,检测分析物浓度低于100 nmol/L。实验结果显示,该方法能形成良好的结合解离曲线,不同浓度范围内呈现明显的跨度,并且具有良好的实验重复性。这种无需标记的单克隆抗体与Fc受体结合力检测方法,对于研究蛋白相互作用以及复杂生物样品的检测具有重要意义。

柔肝调神针刺法联合右佐匹克隆在脑卒中患者术后康复中的应用

目的观察柔肝调神针刺法联合右佐匹克隆对脑卒中患者术后康复情况及睡眠障碍的影响。方法选取100例脑卒中患者,按照随机数字表法分为西医组和中西医组,每组50例。西医组予以常规西医治疗及右佐匹克隆治疗,中西医组在西医组治疗基础上联合柔肝调神针刺法治疗,比较两组患者的神经功能、不良情绪、睡眠情况及预后情况。结果在不同治疗方案下,中西医组的脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)的水平均高于西医组,差异具有统计学意义(P<0.05);中西医组的焦虑自评量表(SAS)评分、抑郁自评量表(SDS)评分均低于西医组(P<0.05);中西医组的匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)、阿森斯失眠量表(AIS)评分均低于西医组,褪黑素水平高于西医组(P<0.05);中西医组的不良预后发生率低于西医组(P<0.05)。结论柔肝调神针刺法联合右佐匹克隆能改善脑卒中患者的脑神经功能,对促进患者不良情绪、睡眠障碍恢复,并降低不良预后发生风险均有积极意义。

一种PCR产物克隆的新方法——T-A克隆法

介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体．将βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段克隆入自制的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体，经ＥｃｏＲⅠ及ＨｉｎｄⅢ双酶切得到与设定长度一致的βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段．

单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆

利用单菌落PCR法直接筛选含有GFP、LTB-ST外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增的结果一致。同时,单菌落PCR法也可应用于重组质粒转化后的农杆菌的筛选,单菌落PCR法的扩增结果和农杆菌液扩增的结果一致。结果表明,单菌落PCR法是一个有效简便的鉴定重组阳性克隆的方法。

单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较

以人绒毛膜促性腺激素(HCG)为抗原,制备出对HCG的多克隆抗体和特异性单克隆抗体,并进行抗体纯化和特性分析,利用辣根过氧化物酶(HRP)分别对其进行了标记。采用双抗夹心ELISA试验,探讨了多克隆抗体与单克隆抗体配对的若干事项。结果表明,利用单克隆抗体和酶标多克隆抗体配对,并用含动物血清的稀释液稀释酶标抗体,可实现对检测原的高特异性和高灵敏度检测。

呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

本研究针对呋喃唑酮代谢物(AOZ),设计合成了系列半抗原,进一步通过偶联牛血清白蛋白(BSA)免疫Balb/c小鼠、细胞融合、筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原H3的具有高亲和力(亲和力常数6.68×1010 L/mol)和高特异性(与其它功能类似物交叉反应小于0.1%)抗AOZ单克隆抗体。同时,基于设计合成的系列同/异源半抗原/包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA方法灵敏度的影响。另外,采用最佳的特征结构异源包被原H5-OVA,建立了以对硝基苯甲醛(p-NP)为衍生剂的AOZ间接竞争ELISA(icELISA)和直接竞争ELISA(dcELISA)检测方法。结果表明:icELISA模式的AOZ检测IC50为0.503μg/L,定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.06～14.0μg/L,检出限(IC10)达0.017μg/L;dcELISA模式的AOZ检测IC50为1.19μg/L,定量检测线性范围为0.14～23.6μg/L,检出限为0.056μg/L。两种方法对AOZ的检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求,可满足不同需求的实际样品检测。

应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。

氟甲喹单克隆抗体制备、鉴定及间接竞争酶联免疫吸附分析法

以氟甲喹(FLU)为原料,合成4个碳原子手臂的半抗原(FLUABA),采用活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原,通过免疫Balb/c小鼠及细胞融合,获得1株稳定分泌抗氟甲喹单克隆抗体的杂交瘤细胞株DB6-E7,其抗体亚类为IgG1,亲和力常数(KA)为8.19×108L/mol。将氟甲喹、FLUABA及6个碳原子手臂的半抗原FLUACA分别与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,研究异源包被对间接竞争ELISA灵敏度的影响。结果表明,异源包被可显著提高ELISA方法的灵敏度。基于最佳异源包被(FLU-OVA)的酶联免疫吸附分析法的IC50为26.33μg/L,检出限为4μg/L,定量检测范围为8.0～114μg/L(IC20～IC80)。与喹诺酮类药物及结构类似物几乎不存在交叉反应,特异性高。此方法可满足畜禽产品中氟甲喹残留的快速筛查。

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体(mAb),并初步建立ZEN的胶体金免疫层析检测方法。方法采用活泼酯法制备人工抗原ZEN-OVA和ZEN-BSA,以ZEN-OVA作为免疫原制备ZEN mAb。ELISA法鉴定抗体效价、亚类、特异性等。ZEN mAb-胶体金复合物包被于胶体金结合垫上,检测原ZEN-BSA和山羊抗小鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上作为检测线(T线)和质控线(C线),建立ZEN的胶体金免疫层析检测法。结果经紫外分光光度法和SDS-PAGE鉴定,ZEN人工抗原合成成功。经3次克隆化后,筛选出1株能稳定分泌ZEN mAb的杂交瘤细胞株1G4,腹水效价为1∶1.6×105;抗体亚类为IgG2b;对ZEN的IC50为10.2 ng/mL,检测限为0.58 ng/mL。mAb对ZEN具有高度的特异性,除与β-玉米赤霉烯醇的交叉反应率为12.8%外,与其他ZEN代谢物α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮及其他相似毒素呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A等几乎无交叉反应。制备的胶体金免疫层析试纸条在5 min内即可肉眼观察到结果,对ZEN的最低检测限为100 ng/mL。结论成功制备出1株ZEN mAb,并初步建立了其胶体金免疫层析检测方法,最低检测限为100 ng/mL。

双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

采用活泼酯法将双酚A的结构类似物双酚酸与载体蛋白偶联制备人工抗原,用制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法进行细胞融合制备双酚A单克隆抗体,成功获得一株分泌抗双酚A单克隆抗体的细胞株3H1,经鉴定抗体属于Ig G1亚型,轻链为κ,并建立了间接竞争酶联免疫分析法。线性范围为1～50 ng/m L,最低检测限为0.43 ng/m L,半数抑制浓度为6.56 ng/m L。回收率为82.83%～101.94%,变异系数为2.94%～12.95%。该方法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。

鼠疫F1单克隆抗体的胶体金标记及斑点渗滤法检测F1抗原方法的建立

目的建立斑点渗滤法快速检测鼠疫F1抗原的方法。方法粗提鼠疫F1单克隆抗体,在pH8.2下对其进行胶体金标记,以兔抗F1抗体与金标记的单克隆抗体建立斑点渗滤快速检测鼠疫F1抗原的方法,并对该方法进行特异性与敏感性试验。结果成功建立斑点渗滤法快速检测鼠疫F1抗原的方法,该检测可在15min内完成,敏感性为3.12mg/L,对假结核、小肠结肠炎等近缘菌的特异性实验未发现交叉反应。结论该方法可作为鼠疫快速诊断的手段,但实验敏感性有待进一步提高。

桁架结构优化设计的免疫克隆选择算法

为了解决带有应力约束和位移约束的桁架的尺寸优化问题,将免疫克隆选择算法应用于结构的尺寸优化设计.根据免疫学基本原理,在基本克隆选择算法的基础上引入精英策略,并给出合理的参数值.在桁架结构优化的数学模型中,采用惩罚函数法处理违反约束的情况.最后对几个经典的桁架进行了优化.数值结果表明,改进的免疫克隆算法收敛速度快、鲁棒性好,可以应用于桁架结构的优化设计.

两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5

目的建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法将含mAb2F5的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换预处理后,先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)纯化,去除大部分杂蛋白,再经凝胶过滤层析法(gelfiltration,GF)精细纯化,并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb2F5纯度的影响。纯化的mAb2F5的生物学活性用3H-TdR掺入法进行分析。结果以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28mAb2F5的纯度大于90%,总回收率达70%。纯化的mAb2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用;而且其促增殖作用的活性优于ProteinG亲和层析法(affinitychro-matography,AC)纯化所获得mAb。结论建立的两步串联层析纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高、生物学活性好。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

烟草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以烟草品种K326叶片总RNA为模板扩增出烟草法呢基焦磷酸合酶基因fps,克隆至载体PMD19-T中。序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长702 bp,共编码234个氨基酸残基,其核酸序列与玉米、杜仲、拟南芥、青蒿、Nicotiana sanderae×Nicotiana langa-dorffii杂交种的法呢基焦磷酸合酶基因的核酸序列同源性分别为74%,76%,77%,80%和97%。

百合无症病毒单克隆抗体制备及快速检测方法的建立

百合无症病毒(Lily symptomles virus,LSV)属于线形病毒科(Flexiviridae)、麝香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus),是危害百合的主要病毒之一。LSV 的寄主范围很窄,只限于百合科(Liliaceae)植物, 单独侵染百合常为隐症,与其他病毒复合侵染时产生花叶、畸形、坏死斑等症状,严重影响百合切花的经济价值。近年来,我国百合种植规模不断扩大, 病毒病发生日趋严重。为了防止病毒随种球扩散与传播,迫切需要建立灵敏、快速的病毒检测方法。我们在百合病毒分子生物学研究的基础上,首次成功制备了LSV单克隆抗体,建立了以单抗为核心的间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)、免疫斑点法(Dot-ELISA) 和组织印迹法(Tissue blot-ELISA)等快速检测 LSV的方法。

RGA法克隆候选抗病基因的研究进展

RGA法是克隆植物抗病基因的一条新途径,也是近年来分子生物学领域的一个研究热点并受到植物病理学家广泛地关注。其作用原理是根据已克隆植物抗病基因的保守结构域设计简并引物,扩增获得RGAs,然后分析RGAs与抗病基因的关系,确定候选抗病基因并从而获得新的抗病基因。研究还发现,已克隆的RGAs与R基因紧密连锁。最近获得的RGAs主要是根据NBS-LRR和STK两种保守结构域而得到的。前者在植物基因组中广泛存在,而后者在植物信号传导中具有重要作用。为此,本文主要对上述两种保守结构域的结构特点和所获得的RGAs特点以及RGA法的应用前景进行了综述,以期让人们对RGA法有更进一步的认识。