黄芩苷通过调节Nrf2/HO-1信号通路减轻阿霉素诱导的H9c2细胞毒性

目的探讨黄芩苷对阿霉素(Dox)诱导的H9c2细胞毒性的影响及内在机制。方法采用50μmol/L黄芩苷预处理H9c2细胞24 h,然后1μmol/L Dox处理H9c2细胞24 h,建立体外Dox心肌毒性模型。采用CCK8法检测细胞活力;收集细胞上清检测各组心肌损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的水平以及氧化应激相关指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的水平;使用DHE试剂盒检测各组活性氧(ROS)的含量;使用TUNEL染色检测各组细胞凋亡水平,RT-qPCR和Western blot实验用于检测氧化应激和凋亡相关分子的表达水平。结果与Dox组相比,黄芩苷能提高H9c2细胞活力,降低LDH、cTnI、CK-MB水平;DHE染色显示黄芩苷能减少ROS的生成,增加SOD、GSH-Px的活性,降低MDA的含量;TUNEL染色结果显示黄芩苷能减少阳性细胞数量;RT-qPCR和Western blot检测显示黄芩苷能上调Nrf2、HO-1、SOD2、Bcl-2的表达,降低Cleaved-caspase 3和Bax的表达。然而,Nrf2的特异性抑制剂ML385可逆转黄芩苷引起的上述变化。结论黄芩苷通过上调Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激和凋亡,减轻Dox诱导的H9c2细胞毒性。

活血补肾安神方调控AhR-JDP2-Nrf2轴改善H9c2细胞氧化损伤的机制研究

目的基于AhR-JDP2-Nrf2轴探讨活血补肾安神方改善H9c2细胞氧化损伤的作用机制。方法将H9c2细胞分为正常组、模型组、中药组、曲美他嗪组、空质粒组、过表达组、中药+过表达组、曲美他嗪+过表达组,采用H_(2)O_(2)诱导氧化应激模拟心肌损伤,转染Jun二聚化蛋白2(JDP2)过表达基因,分别予活血补肾安神方和盐酸曲美他嗪干预。流式细胞仪检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞上清液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)含量,Western blot检测H9c2细胞芳香烃受体(AhR)、JDP2、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)蛋白表达,RT-qPCR检测AhR、JDP2、Nrf2、HO-1mRNA表达。结果与正常组比较,模型组H9c2细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率升高(P<0.01),细胞上清液MDA、SOD、NADPH含量升高(P<0.05),细胞AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,中药组和曲美他嗪组H9c2细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率显著降低(P<0.01),细胞上清液MDA、SOD、NADPH含量降低(P<0.05),中药组H9c2细胞AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05)。与空质粒组比较,过表达组H9c2细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率升高(P<0.01),细胞上清液MDA、NADPH含量升高(P<0.01),SOD含量降低(P<0.01),细胞AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达升高(P<0.05);与过表达组比较,中药+过表达组和曲美他嗪+过表达组H9c2细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01),细胞上清液MDA、NADPH含量降低(P<0.01),SOD含量升高(P<0.01),细胞AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05)。结论活血补肾安神方可能通过调节JDP2表达调控AhR-JDP2-Nrf2轴,减轻H9c2细胞氧化损伤,抑制心肌细胞凋亡,发挥保护心肌细胞作用。

miR-223-3p在高糖诱导的H9c2细胞损伤中的靶基因预测及相关通路分析

[目的]通过生物信息学途径探究miR-223-3p在高糖环境下对H9c2细胞的影响,并结合转录组测序结果,分析其在糖尿病心肌病发病机制中的作用,旨在分子层面上发掘新的治疗靶点,探究miR-223-3p的具体作用机制。[方法]在高糖培养的H9c2细胞中分别转染miR-223-3p的抑制物及对照物,RT-qPCR检测两组细胞中miR-223-3p的表达差异;通过高通量测序对差异mRNA进行检测;用TopGO软件进行GO功能富集分析;DESeq2软件(v1.16.1)筛选差异表达基因,对检测结果的差异基因与miR-223-3p靶基因数据库共分析,预测miR-223-3p靶基因,并用RT-qPCR检测验证其表达变化。[结果]高糖处理的H9c2细胞活性明显降低,转录组测序结果提示对照组和miR-223-3p抑制剂组间的基因表达存在较为明显的差异。GO功能富集分析显示,预测靶基因集显著富集于G蛋白偶联受体活性、甘油基乙醚单加氧酶活性、细胞阴离子稳态和氯离子稳态等方面。KEGG通路富集分析显示,这些基因主要涉及TNF信号通路和IL-17信号通路。此外,它们还与1型糖尿病、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用等相关疾病和生理过程有关。靶基因预测提示miR-223-3p可能与Cxcl10、Creb3l3、Mmp3和Bcl3等的表达变化有关。[结论]在高糖诱导的H9c2细胞损伤中miR-223-3p及其下游靶基因的预测可能为糖尿病心肌病的治疗提供新的靶点,对于揭示糖尿病心肌病的发病机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。

基于AMPK/mTOR通路探讨注射用益气复脉对TBHP诱导H9c2细胞损伤的保护作用

目的:探讨注射用益气复脉(YQFM)通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬减轻叔丁基过氧化氢(TBHP)所致H9c2心肌细胞损伤的机制。方法:体外培养H9c2心肌细胞,分为正常对照组、TBHP组、TBHP+YQFM组。CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞存活率;免疫荧光检测细胞自噬情况;免疫印迹法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达。结果:用2、4、8、16 g/L的YQFM预处理后,可显著恢复TBHP诱导的H9c2细胞损伤;免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,TBHP组细胞LC3荧光强度显著升高(P<0.01);与TBHP组相比,TBHP+YQFM组LC3荧光强度降低,其中2 g/L YQFM组具有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果显示:TBHP组p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著增加,p-mTOR/mTOR比率显著降低;YQFM预处理使自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率明显降低,4 g/L YQFM组p-mTOR/mTOR比率明显升高。结论:注射用益气复脉能有效拮抗TBHP引起的H9c2细胞损伤,其机制与通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬途径有关。

3,3'-二吲哚甲烷对脂多糖诱导的H9c2细胞氧化应激和增殖的影响

目的观察3,3'-二吲哚甲烷(DIM)对脂多糖(LPS)诱导H9c2细胞增殖及氧化应激的影响。方法2022年10—12月于武汉大学人民医院代谢与相关慢病湖北省重点实验室进行实验,采用LPS(10 mg/ml)刺激H9c2细胞,并用不同浓度的DIM[10、20、30μmol/L]进行干预。活细胞计数试剂盒(CCK-8)检测H9c2细胞增殖能力;通过检测细胞内活性氧基团(ROS)水平并分析LPS对H9c2细胞的毒性作用。结果CCK-8结果提示,DIM对H9c2细胞活性无显著影响(P>0.05),LPS可提高H9c2细胞的增殖活性(P<0.01),当DIM与LPS同时作用时,可明显降低LPS对H9c2细胞增殖活性的提升(LPS+DIMⅠ组:F=7.451,P=0.002,LPS+DIMⅡ组:F=8.822,P=0.001,LPS+DIMⅢ组:F=10.460,P=0.001);LPS可增加H9c2细胞内ROS水平(P<0.05),当DIM与LPS同时作用时,ROS水平显著降低(LPS+DIMⅠ组:F=27.440,P<0.001,LPS+DIMⅡ组:F=14.060,P<0.001,LPS+DIMⅢ组:F=18.760,P<0.001),且随着药物浓度增加下降趋势更明显(P<0.01)。结论DIM可通过抑制LPS诱导的H9c2细胞氧化应激并改善H9c2细胞的增殖活性。

基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路的黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2细胞坏死性凋亡的影响

目的观察黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞坏死性凋亡的影响,基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路探讨其作用机制。方法体外培养H9C2细胞,建立缺氧/复氧模型。将细胞分为对照组、模型组、黄芪丹参+激活剂(油酸)组、黄芪丹参组和抑制剂(KN-93磷酸盐)组,分别于相应培养基培养。试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-qPCR和Western blot检测钙调蛋白激酶(CaMK)Ⅱδ、受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组细胞上清液LDH水平显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,黄芪丹参组细胞上清液LDH水平显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。黄芪丹参作用与CaMKⅡδ抑制剂KN-93磷酸盐相当。结论黄芪-丹参配伍可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,抑制心肌细胞坏死性凋亡,其机制与下调CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路有关。

二氢丹参酮Ⅰ对氧糖剥夺/复氧复糖诱导H9c2细胞损伤的影响及作用机制研究

目的观察二氢丹参酮Ⅰ(DHT)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的大鼠心肌细胞H9c2损伤的影响,探讨其保护心肌的作用机制。方法将H9c2细胞分为对照组、模型组和DHT组,CCK-8法检测细胞活力,转录组测序对差异表达基因进行分析,绘制Venn图、热图,并进行聚类分析;应用KEGG数据库对差异基因进行GO和KEGG通路富集分析,并通过RT-qPCR和Western blot验证差异基因表达。结果CCK-8检测结果显示,与对照组比较,模型组H9c2细胞活力显著降低(P<0.01);与模型组比较,DHT组H9c2细胞活力显著升高(P<0.01)。组间差异基因分析结果显示,对照组与模型组差异基因有170个上调、426个下调,对照组和DHT组差异基因有345个上调、775个下调,模型组和DHT组差异基因有3个上调、14个下调。差异基因富集分析结果显示,DHT对OGD/R诱导的H9c2细胞损伤的保护的信号通路有乙型肝炎、坏死性凋亡、病毒致癌、人T细胞白血病病毒1感染、戊糖磷酸途径、酒精中毒、中性粒细胞外陷阱形成、C型凝集素受体信号通路、系统性红斑狼疮。验证结果显示,与对照组比较,模型组细胞EGR2、Junb、rpl13、Trir基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,DHT组细胞EMC6、rpl13、Trir基因表达显著升高(P<0.01),EGR2、Junb基因表达有升高趋势,与转录组测序分析结果一致。同时,DHT可以上调EGR2、Junb、rpl13蛋白表达。结论DHT对OGD/R诱导的H9c2细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与上调EGR2、EMC6、Junb、rpl13和Trir表达有关。

NSUN2对阿霉素诱导H9C2细胞损伤的作用及机制

目的:探讨NSUN2对阿霉素(doxorubicin, DOX)诱导H9C2细胞损伤的作用及可能机制。方法:H9C2细胞分两组,对照组(加入0.9%氯化钠溶液2μL)和DOX组加入用0.9%氯化钠溶液配置成0.5 mg/mL阿霉素2μL、siNSUN2转染H9C2细胞、腺病毒转染人源NSUN2建立NSUN2稳定过表达H9C2细胞系,加入阿霉素500 ng/mL共培养24 h后,用DCFH-DA探针、Western blot、免疫荧光、TUNEL染色等方法检测细胞的活性氧(ROS)、凋亡及NSUN2的变化,ELISA检测细胞培养基上清内NSUN2表达变化。结果:Western blot结果显示,DOX组与对照组比较,H9C2细胞Bax蛋白水平及NSUN2表达水平升高(P<0.01),Bcl-2蛋白水平下降(P<0.01);ELISA检测细胞培养液内NSUN2表达水平DOX组较对照组升高(P<0.05);TUNEL结果显示DOX组细胞凋亡明显增加;DCFH-DA探针检测DOX组细胞内ROS水平较对照组明显升高;H9C2细胞敲减NSUN2后,DOX组细胞内Bax蛋白水平较对照组升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.01);NSUN2过表达时,DOX组与对照组比较,细胞内Bax表达水平下降(P<0.01),Bcl-2表达水平升高(P<0.01)。结论:NSUN2能抑制阿霉素诱导的H9C2细胞损伤,对其H9C2细胞起保护作用,机制可能与NSUN2抗氧化应激相关。

山姜素靶向调控Nrf2抑制H9C2细胞氧化应激反应

目的 观察山姜素(alpinetin,ALP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠心肌细胞(H9C2)的作用,并探讨其机制。方法 采用不同因素干预H9C2细胞后,使用细胞毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)检测细胞活性;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence PCR,RT-PCR)检测基因的表达;Western blot检测蛋白的表达;酶标仪及免疫荧光显微镜检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达;试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活力。结果 细胞活性:LPS组细胞活性明显低于对照组(P <0.01),加入山姜素后,可显著提高细胞活性(P <0.01),LPS组LDH活性明显高于对照组(P <0.01);氧化应激分子及基因表达:与对照组相比,LPS组心肌细胞中ROS的表达水平显著上调,细胞内MDA含量显著升高,SOD活力显著下降,抗氧化因子基因表达水平均被显著抑制(P <0.01),加入ALP后可显著抑制ROS的表达水平及细胞内MDA含量,提高细胞内SOD含量,同时上调抗氧化因子基因表达水平(P <0.01);信号通路:LPS组中Keap1蛋白表达水平高于对照组,Nrf2蛋白表达水平低于对照组(P <0.01),加入ALP(10 mg/L)后可逆转以上两种蛋白的表达水平(P <0.01);验证机制:与LPS组相比,LPS+ALP(10 mg/L)可抑制ROS的表达(P <0.01),加入siNrf2后则可显著逆转ALP带来的保护作用,ROS水平显著上调(P <0.01),抗氧化因子基因表达水平同样得到证实。结论 山姜素可靶向调控Nrf2信号通路的活化从而改善LPS诱导的H9C2氧化应激反应。

低温缺氧/复氧后大鼠心肌成纤维细胞对心肌H9c2细胞间通讯的影响

目的观察低温缺氧/复氧(hypothermia hypoxia/reoxygen,H/R)后大鼠心肌成纤维细胞(rat cardiac fibroblasts,RCFs)对心肌H9c2细胞间通讯的影响并探讨其可能机制。方法将RCFs细胞与H9c2细胞以2:1数量比Transwell共培养后随机分为6组。其中T+AngⅡ组及H/R⁃T+AngⅡ组加入1.5 nmol/L AngⅡ,T+ARB组及H/R⁃T+ARB组加入1 nmol/L缬沙坦。T组、T+AngⅡ组及T+ARB组进行正常培养,H/R⁃T组、H/R⁃T+AngⅡ及H/R⁃T+ARB组进行H/R处理。检测各组培养液中AngⅡ含量;H9c2细胞Cx43、ERK1/2表达量及磷酸化及细胞间通讯情况。结果与T组相比,H/R⁃T组及T+AngⅡ组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平降低(P<0.05),细胞间通讯减弱(P<0.05);T+ARB组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增高(P<0.05),细胞间通讯增强(P<0.05)。与H/R⁃T组相比,H/R⁃T+AngⅡ组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平降低(P<0.05),细胞间通讯减弱(P<0.05);H/R⁃T+ARB组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增加(P<0.05),细胞间通讯增强(P<0.05)。结论H/R处理后,RCFs细胞分泌增多的AngⅡ可能通过抑制H9c2细胞MAPK/ERK通路下调Cx43表达,导致H9c2细胞间通讯减弱。

Elabela对同型半胱氨酸诱导的H9C2细胞凋亡的影响与机制

目的探究多肽Elabela(ELA)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的H9C2细胞凋亡的作用及机制。方法采用CCK-8检测细胞活性,根据试验结果选择Elabela和Hcy的适宜浓度建立细胞实验模型。随机将细胞分成NC组(正常对照组)、ELA组、Hcy组、Hcy+ELA组。使用试剂盒检测ROS含量;利用TUNEL荧光染色和流式细胞术检测细胞的凋亡程度;通过Western印迹法检测H9C2细胞中PARP、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白以及MAPK信号通路相关蛋白的表达水平。使用ERK特异性抑制剂U0126验证相关信号通路作用,检测细胞中凋亡相关蛋白的表达水平。结果与NC组相比,1 mmol/L的Hcy处理使H9C2细胞活性明显下降(P<0.001),而10μmol/L的Elabela显著逆转了Hcy诱导的H9C2细胞活性下降(P<0.001)。与Hcy处理组相比,Elabela的干预使细胞内ROS的产生减少,凋亡率下降,促凋亡蛋白cleaved-PARP、Bax、cleaved-Caspase3蛋白的表达水平下调,而Bcl-2、p-ERK蛋白的表达水平上调,p-P38、p-JUNK蛋白的表达水平下调(均P<0.05)。与Hcy+ELA组相比,U0126的干预抑制了Elabela对H9C2细胞的保护作用,使细胞促凋亡相关蛋白的表达水平上调,而Bcl-2的表达水平下调(均P<0.05)。结论多肽Elabela可能通过调节ERK/MAPK信号通路抑制Hcy诱导的H9C2细胞的凋亡。

蓝萼甲素对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤模型HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨蓝萼甲素(GLA)对缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2细胞损伤的保护作用以及与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的关系。方法:体外培养H9c2心肌细胞并构建H9c2细胞H/R损伤模型,实验分为6组:对照组(正常培养)、模型组(构建H/R细胞模型)、GLA-L组(细胞中加入5μmol/L的GLA后构建H/R细胞模型)、GLA-M组(细胞中加入10μmol/L的GLA后构建H/R细胞模型)、GLA-H组(细胞中加入20μmol/L的GLA后构建H/R细胞模型)、GLA-H+甘草素组(细胞中加入20μmol/L的GLA和100μg/mL的HMGB1/TLR4/NF-κB通路抑制剂甘草素后构建H/R细胞模型)。CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;试剂盒测定细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组H9c2细胞存活率和SOD含量明显降低,细胞凋亡率、LDH、MDA、ROS、TNF-α、IL-6含量及HMGB1、TLR4表达与NF-κB p65磷酸化水平均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组H9c2细胞存活率和SOD含量明显升高,细胞凋亡率、LDH、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量及HMGB1、TLR4表达与NF-κB p65磷酸化水平明显降低,均呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05)。与GLA-H组相比,GLA-H+甘草素组H9c2细胞HMGB1、TLR4表达与NF-κB p65磷酸化水平、细胞凋亡率、LDH、MDA、ROS、TNF-α、IL-6含量均进一步下降,细胞存活率和SOD含量进一步上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:GLA可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路,降低细胞凋亡率,减少炎性因子表达,进而保护H9c2细胞免受H/R诱导损伤。

甘草酸通过ROS依赖性NLRP3炎性通路减轻缺氧H9c2细胞损伤的实验研究

目的:观察甘草酸(GA)对缺氧H9c2细胞炎症、氧化应激的影响,并探讨其潜在作用机制。方法:将正常培养的H9c2细胞设置为对照组,缺氧培养H9c2细胞设置为缺氧组;GA、GA+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理的缺氧H9c2细胞设置为缺氧+GA组、缺氧+GA+NAC组;将生理盐水、双蒸水+GA处理的缺氧H9c2细胞设置为缺氧+生理盐水组、缺氧+GA+双蒸水组。采用细胞计数试剂盒(CCK8)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色法测定细胞增殖;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS);实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞NOD样受体蛋白3(NLPR3)mRNA表达。结果:与对照组比较,缺氧组H9c2细胞存活率、EdU阳性率均降低,细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量及ROS、NLRP3 mRNA水平均升高,SOD含量降低(P<0.05);与缺氧+生理盐水组比较,缺氧+GA组H9c2细胞存活率、EdU阳性率均升高,细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量及ROS、NLRP3 mRNA水平均降低,SOD含量升高(P<0.05)。与缺氧+GA+双蒸水组比较,缺氧+GA+NAC组H9c2细胞ROS、NLRP3及TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA降低,SOD含量升高(P<0.05)。结论:GA可减轻缺氧诱导H9c2细胞的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性NLRP3炎性通路有关。

LncRNA KCNQ1OT1调控miR-10a-5p加重缺氧复氧H9c2细胞损伤的机制

目的探讨长非编码RNA KCNQ1重叠转录本1(KCNQ1OT1)调控缺氧复氧(H/R)心肌细胞(H9c2)增殖、凋亡的作用机制。方法成功建立H/R H9c2细胞模型;采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)、细胞计数试剂盒(CCK8)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒、蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞中KCNQ1OT1、miR-10a-5p的表达、细胞活性、细胞凋亡率及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光素酶活性。结果与H9c2组比较,H/R H9c2组细胞KCNQ1OT1表达显著升高,miR-10a-5p表达显著降低(P<0.05);过表达KCNQ1OT1或抑制miR-10a-5p具有相同的加重H/R对H9c2细胞的活性抑制、凋亡促进及P65、Bcl-2下调,PHB、Bax上调作用。miR-10a-5p明显抑制野生型KCNQ1OT1细胞的荧光活性,并负向调控KCNQ1OT1的表达。过表达miR-10a-5p部分逆转KCNQ1OT1对H/R H9c2细胞的活性抑制和凋亡促进作用。结论长链非编码RNA KCNQ1OT1抑制H/R H9c2细胞增殖,促进凋亡,其机制与靶向miR-10a-5p有关。

生物钟基因Bmal1对高糖高脂H9C2细胞缺氧/复氧损伤的影响及分子机制探讨

目的:探讨生物钟基因Bmal1对高糖高脂H9C2细胞缺氧/复氧损伤的影响及分子机制。方法:采用随机数字表法将36个H9C2细胞分为低糖+常氧组(LG+N组)、低糖+缺氧/复氧组(LG+H/R组)、高糖高脂+常氧组(HG/HP+N组)、高糖高脂+缺氧/复氧组(HG/HP+H/R组)、高糖高脂+缺氧/复氧+Bmal1过表达组(HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组)、高糖高脂+缺氧/复氧+Bmal1过表达+PI3K抑制剂Wortmannin组(HG/HP+H/R+Ad-Bmal1+Wort组),每组6个。比较各组H9C2细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞凋亡率、细胞存活率,Bmal1、磷酸化AKT蛋白/AKT蛋白(p-Akt/Akt)、Bax的表达水平。结果:LG+H/R组、HG/HP+N组的Bmal1表达量低于LG+N组,细胞损伤程度高于LG+N组,差异有统计学意义(P<0.05);HG/HP+H/R组Bmal1表达量低于LG+H/R组,细胞损伤程度高于LG+H/R组,差异有统计学意义(P<0.05);HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组细胞损伤程度低于HG/HP+H/R组,差异有统计学意义(P<0.05);HG/HP+H/R+Ad-Bmal1+Wort组细胞损伤程度高于HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组,差异有统计学意义(P<0.05)。HG/HP+H/R组p-Akt/Akt、Bax表达量高于HG/HP+N组,Bmal1表达量低于HG/HP+N组,差异有统计学意义(P<0.05);HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组Bax表达量低于HG/HP+H/R组,Bmal1和p-Akt/Akt表达量高于HG/HP+H/R组,差异有统计学意义(P<0.05);HG/HP+H/R+Ad-Bmal1+Wort组Bax表达量高于HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组,p-Akt/Akt表达量低于HG/HP+H/R+Ad-Bmal1组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:高糖高脂可降低心肌细胞中生物钟基因Bmal1的表达水平,Bmal1通过激活PI3K/Akt信号通路减少细胞凋亡,从而起到保护高糖高脂H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。

黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用和机制研究

目的:探讨黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用及其可能作用机制。方法:采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)方法筛选H9c2细胞培养的黄芪注射液浓度;H9c2细胞分为正常对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ+黄芪注射液组。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测3组H9c2细胞电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)及分子伴侣葡萄糖调节蛋白75(GRP75)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达;Fura-2 AM法测定细胞内Ca^(2+)浓度变化;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:黄芪注射液在浓度为0.125%时对细胞的促增殖作用最为显著。与正常对照组比较,AngⅡ模型组Mfn2、GRP75 mRNA表达水平明显增加(P<0.05),AngⅡ+黄芪注射液组Mfn2、GRP75 mRNA表达低于AngⅡ模型组(P<0.05或P<0.01),而3组VDAC1 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组VDAC1、Mfn2和GRP75的蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达低于AngⅡ模型组(P<0.01)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组细胞钙含量、细胞凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组细胞钙含量、细胞凋亡率低于AngⅡ模型组(P<0.01)。结论:黄芪注射液能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与其调节VDAC1、Mfn2和GRP75等MAM结构蛋白表达和影响细胞内钙平衡有关。

黄芪总皂苷对三氧化二砷诱导H9c2细胞损伤的保护作用

为探讨黄芪总皂苷(ASTs)对三氧化二砷(ATO)诱导H9c2细胞损伤的保护作用及其机制,采用6μg·mL^(-1) ATO孵育12 h建立H9c2细胞损伤模型.实验设空白组、模型组、ASTs低/中/高浓度组,ASTs组预孵育12 h,弃去含药培养基,继续用6μg·mL^(-1) ATO孵育12 h,终止实验.通过CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡程度,流式细胞术定量测定细胞凋亡率,RT-qPCR测定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达水平,Western Blot测其蛋白.结果表明:ATO能够显著降低心肌细胞存活率、增加凋亡率(P<0.05);与ATO模型组比较,ASTs各组能显著提高细胞存活率,降低细胞凋亡率(P<0.05),降低Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表达水平,增加Bcl-2 mRNA表达水平(P<0.05),显著降低细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平(P<0.05),升高Bcl-2/Bax比值(P<0.05).故ASTs对ATO诱导H9c2细胞凋亡具有保护作用,其机理可能与抑制细胞凋亡有关.

花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢诱导的H9c2细胞损伤的作用机制

目的:探究花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的H9c2细胞损伤的作用机制。方法:将H9c2细胞暴露于不同浓度H_(2)O_(2)中4、8、12 h诱导细胞毒性,同时以不同浓度花青素-3-葡萄糖苷处理细胞,并设置阳性对照组(1.5 mg/mL益气活血颗粒),采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,Hoechst 33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法检测细胞中解偶联蛋白2(UCP2)表达,二氢乙锭(DHE)染色检测活性氧(ROS)含量,蛋白免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及切割后半胱天冬酶3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果:600μmol/L的H_(2)O_(2)处理4 h为最佳造模条件,50.00μmol/L为花青素-3-葡萄糖苷最适药物干预浓度。与对照组比较,H_(2)O_(2)组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表达明显升高,UCP2 mRNA及蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+花青素-3-葡萄糖苷组和H_(2)O_(2)+益气活血颗粒组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表达明显降低,UCP2 mRNA及蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。shRNA-3可明显降低细胞中UCP2蛋白表达,与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+shRNA-3组UCP2、Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达及ROS含量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与H_(2)O_(2)+shRNA-3组比较,花青素-3-葡萄糖苷处理后UCP2、Bcl-2蛋白表达明显升高,Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达ROS含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:花青素-3-葡萄糖苷对H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞凋亡有显著的保护作用,其机制可能与上调UCP2表达,从而降低Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达,清除ROS有关。

α-硫辛酸对在H9c2细胞在H_2O_2导致的氧化应激损伤中的保护作用

缺血再灌注产生的氧自由基会导致心肌细胞凋亡.近年研究发现,α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)具有抗氧化作用,但LA是否能够对抗心肌细胞凋亡,保护心脏功能的作用尚未明确.本研究利用H2O2诱导的心肌细胞H9c2氧化应激模型,分别用CCK-8方法检测细胞存活率、Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、real-time PCR法检测Bcl-2/Bax基因表达变化,评价LA是否具有对抗氧化损伤引起的心肌细胞凋亡能力.结果显示,LA能提高H2O2损伤的H9c2细胞存活率,降低心肌细胞凋亡,而且LA通过上调Bcl-2的表达而发挥抑制细胞凋亡的作用.研究结果证实,LA对氧化应激损伤的心肌细胞具有较好的保护作用.该研究为LA在临床上用于治疗氧化应激引起的心肌细胞凋亡提供了实验依据.

三七总皂苷对D-半乳糖致H9c2细胞衰老的保护作用研究

目的:探讨三七总皂苷(Panax notoginseng Total Saponins)对D-半乳糖致心肌细胞株H9c2细胞衰老的保护作用及其可能机制。方法:50 mmol/L D-半乳糖处理H9c2细胞建立衰老模型。不同浓度三七总皂苷(5、25、50μg/mL)预处理细胞4 h,再加入D-半乳糖继续培养24 h。β-半乳糖苷酶染色法鉴定细胞衰老程度,DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen species,ROS)水平,生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,Hochest染色分析细胞凋亡情况。结果:与正常对照组比较,D-半乳糖组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数目显著增多,ROS荧光强度显著上升,SOD活性降低,MDA含量增加,Hochest染色发现细胞核染色质浓缩和凝聚,并可见大量凋亡小体;与D-半乳糖组比较,不同浓度三七总皂苷组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数目显著减少,SOD活性显著升高,MDA含量显著降低,ROS荧光强度显著降低,细胞核染色质浓缩和凝聚以及凋亡小体均有所改善。结论:三七总皂苷可通过提高抗氧化能力和减少细胞凋亡来对抗D-半乳糖所致的H9c2细胞衰老。