茶花鸡2号IFN-α基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因(IFN-α)CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。

IFN-α抗病毒治疗118例慢性乙型肝炎并10年随访分析

目的 探讨IFN-α抗病毒治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的效果,为CHB的抗病毒治疗提供参考。方法选取接受普通IFN-α治疗且资料完整的CHB患者118例,通过门诊定期复诊和电话随诊收集患者的乙肝五项[乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)]、乙肝DNA定量(HBV-DNA)和谷丙转氨酶(ALT)水平。比较治疗前后、随访期间不同时间点的HBV-DNA和HBsAg阴转率、HBeAg/HBeAb血清转换率和ALT复常率等。结果 HBV-DNA阴转率及HBsAg阴转率随治疗时间的延长而提高,HBV-DNA阴转率在治疗第24、36、48周时的阴转率明显高于第12周,HBsAg阴转率在治疗第48周明显高于第12周和24周,差异均有统计学意义(P<0.05)。停药后第24~432周各随访节点HBV-DNA阴转率及HBsAg阴转率呈先降后趋于稳定的趋势。HBeAg/HBeAb血清转换率随治疗时间的延长而升高,治疗第48周其转换率明显高于第12周(P<0.05);HBeAg/HBeAb血清转换率及SVR随停药时间的延长呈先降后趋于稳定的趋势。停药后,HBeAg/HBeAb血清转换率在各随访节点差异均无统计学意义(P>0.05)。病毒学复发率停药后先上升,在停药第144周呈现稳定趋势。ALT复常率在停药第144周呈现稳定趋势,停药第144周的ALT复常率明显高于停药第12周(P<0.05)。结论 IFN-α抗病毒治疗CHB可取得较好的疗效,在治疗及停药后各随访节点,HBV-DNA阴转率、HBsAg阴转率、ALT复常率、HBeAg/HBeAb转换率均可获得较高的应答率。

HBV对IFN-α受体表达及IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对干扰素α(IFN-α)受体表达的影响,以及对IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性的影响。方法以HepG2.2.15细胞、HepG2细胞及LO2细胞为细胞模型,采用流式细胞术、Western-blot检测IFN-αR1和IFN-αR2受体的表达;采用Western-blot动态分析IFN-α2b刺激肝细胞核蛋白STAT1的活化;流式细胞术检测IFN-α2b刺激肝细胞MHC-Ⅰ的水平。结果流式细胞术、Western-blot法检测结果显示,HepG2和LO2细胞中IFN-αR1和IFN-αR2受体及蛋白表达均显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,HepG2、LO2细胞中核蛋白p-STAT1的表达显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,MHC-Ⅰ水平在HepG2、LO2细胞中的表达较HepG2.2.15细胞更高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBV的持续存在可降低IFN-αR1和IFN-αR2表达,并降低IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性,推测其可能是导致HBV对IFN-α产生耐药的部分机制。

IFN-αIL-6和IL-17检测对结核病辅助诊断价值

目的:评价血清免疫细胞因子对结核分枝杆菌肺病(TB)的诊断价值。方法:回顾性选取2020年11月至2022年10月于河北省胸科医院就诊的139例疑似肺结核患者作为研究对象。按照2018年最新实施的肺结核诊断标准(WS288-2017),其中确诊结核病69例,纳入结核组,非结核病70例纳入非结核组。采用流式免疫荧光发光法检测血清中免疫相关细胞因子IL-6、IL-17和IFN-α水平,并分析三种因子检测对结核病的诊断效能。结果:结核组患者IL-6浓度和IL-17浓度显著高于非结核组,差异有统计学意义(P<0.05);结核组患者IFN-α浓度略高于非结核组,但差异无统计学意义(P>0.05);进行ROC曲线分析:IL-6检测AUC面积为0.658(P<0.001)、IL-17检测AUC面积为0.734(P<0.001)、IFN-α检测AUC面积为0.571(P<0.001)。结论:MTB感染者IL-6、IL-17水平增高,IL-6、IL-17对结核的诊断具有较好的灵敏度和特异度;IL-6、IL-17在临床辅助诊断结核病具有一定的价值。

表达IFN-α的重组猪繁殖与呼吸综合病毒的构建及生物学特性分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害我国生猪业的重要疫病之一,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),是一种免疫抑制性病毒。干扰素(IFN)是一类具有免疫调节功能和抗病毒作用的细胞因子。IFN-α除更直接的抗病毒作用外,还可以调节宿主的先天性和适应性免疫。论文构建表达IFN-α的重组PRRSV,分析重组病毒的生物学特性以及IFN-α的生物学活性。通过反向遗传操作方法将IFN-α插入到PRRSV ORF1b和ORF2a之间,重组质粒转染细胞后可以拯救出重组病毒(rGXAM-P-IFN-α)。插入到PRRSV基因组中的IFN-α可遗传稳定9代。重组病毒生长特性分析可发现rGXAM-P-IFN-α复制能力显著低于亲本病毒。rGXAM-P-IFN-α感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)可显著上调抗病毒基因(PKR,ISG15和ISG54)mRNA表达水平,为进一步研发新型PRRSV疫苗提供参考。

西藏羊和白-藏杂交羊外周血IFN-α、IgG和IL-2的研究

为了解西藏羊和白萨福克羊与西藏羊的杂交后代羊生长发育中免疫因子的分泌特点和免疫学特征,以西藏羊和白-藏杂交羊为研究对象,应用ELISA方法检测0.5、1和1.5岁外周血中干扰素(IFN-α)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-2(IL-2)的质量浓度,分析其变化规律。结果表明:随年龄的增长,藏公羊IL-2呈逐渐降低的趋势,而藏母羊呈逐渐升高的趋势(P<0.05);藏杂交公羊和藏母羊IgG含量都呈逐渐降低趋势,藏公羊下降较明显(P<0.05);藏公羊IFN-α的含量逐渐降低,0.5岁与1岁之间下降趋势明显(P<0.05),而藏母羊变化不大。随年龄的增长,白-藏杂交羊公羊和母羊IL-2含量先降低再升高;白-藏杂交羊公羊IgG含量变化不大,母羊则是先升高后下降趋势,且1岁和1.5岁之间下降明显(P<0.05);白-藏杂交羊公羊IFN-α的含量逐渐降低,而母羊是先升高后下降。

重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

重组Hu-IFN-α基因在草鱼中的整合和表达

采用显微注射法将人α干扰素(HuIFNα)重组基因转入草鱼Ⅰ～Ⅱ细胞期的受精卵,然后对转化培育出的草鱼个体提取血液总DNA进行PCR和Southern杂交检测及ELISA检测,以研究重组基因在受体基因组上的整合和表达情况。实验结果显示:HuIFNα重组基因能整合在草鱼基因组上,但其整合是随机的,整合位点没有固定区域,而且整合在受体草鱼基因组上的HuIFNα基因的表达率较低,表达水平在个体间有很大差异。大部分转基因个体外源基因表达水平集中在39～74pg/mL之间,表达最高个体HuIFNα浓度为1450pg/mL。

三种IFN-α抗病毒活性新方法的比较

目的:体外研究不同亚型干扰素-α(IFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b)抗HBV活性和信号分子基因应答水平的差异性,以探讨用信号分子作为一种新的抗病毒评价标准的可能性.方法:0.5,1,2,4,8MU/LIFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b作用于2.2.15细胞后,用Abbott诊断试剂盒分别检测上清中HBsAg,HBeAg的含量,并计算其抑制率;1MU/LIFN-α2b,IFN-α2a,IFN-α1b作用于HepG2细胞后,利用RT-PCR及Westernblotting方法检测胞内STAT1,IFNARmRNA及蛋白表达水平的差异性.结果:IFN-α对HBsAg,HBeAg抑制率随药物浓度增加而增强,当IFN-α浓度为0.5,1MU/L时,三组不同亚型IFN-α对HBsAg,HBeAg抑制率无统计学差异.当浓度为2,4,8MU/L时,IFN-α1b组对HBsAg,HBeAg抑制率明显较IFN-α2b,IFN-α2a组高(HBsAg:F=4.51,6.23;HBeAg:F=3.11,4.72,P<0.05),而IFN-α2b,IFN-α2a组间无统计学差异.RT-PCR和Westernblotting结果1Mu/L时,IFN-α1b处理组IFNAR,STAT1mRNA及蛋白表达水平均较IFN-α2b组高,两组比较无统计学差异.IFN-α1b,IFN-α2b处理组IFNAR,STAT1mRNA及蛋白表达水平明显较IFN-α2a组高,均存在统计学差异(mRNA:F=5.26,15.6;蛋白:F=17.7,20.1,P<0.05).结论:IFN-α1b,IFN-α2b抗HBV活性较强,IFN-α2a较弱.用信号分子STAT1,IFNAR来评价IFN-α抗病毒活性则更为敏感.

血红素加氧酶-1通过诱导抗病毒蛋白的表达增强IFN-α抗HBV效应

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对HBV复制的作用及HO-1联合α-干扰素(IFN-α)的抗病毒效应。方法以HepG2.2.15细胞和HBV 1.3质粒转染HepG2细胞即HepG2-HBV1.3为HBV复制细胞模型;血红素(Hemin)分别处理HepG2.2.15和HepG2-HBV1.3细胞,诱导HO-1表达;CCK-8评估Hemin对HepG2、HepG2.2.15的毒性作用;化学发光法分析Hemin处理组及si-HO-1等实验组上清液中HBsAg、HBeAg;RT-qPCR分析HO-1、IFN-β、HBV-DNA;Western blot分析IRF-3、JAK/STAT信号通路中相关分子的表达;Hemin联合IFN-α处理HepG2.2.15,监测HO-1是否具有协同IFN-α抗病毒效应。结果Hemin剂量依赖性诱导HO-1,HO-1被诱导后发挥显著的抗HBV效应,同时IFN-β、IRF-3及JAK/STAT信号通路中IRF-9、MxA的表达均增加。沉默HO-1表达能逆转Hemin诱导组的抗病毒效应,同时I型干扰素IFN-β也呈现低表达,JAK/STAT信号通路中的IRF-9、MxA的表达也被抑制。Hemin联合IFN-α发挥更强的抗病毒作用。结论HO-1能够发挥抗HBV效应,这种效应可能是增加IRF-3的磷酸化诱导I型干扰素表达来激活JAK/STAT信号通路发挥抗病毒效应;HO-1可以协同IFN-α发挥抗病毒作用。

人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白制备和纯化

目的:用生物发酵方法大量制备含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌,用金属亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物,获得大量高纯度的人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白。方法:选取含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌单克隆菌落,通过制备一级及二级种液,按比例加入5L发酵罐中进行发酵,发酵过程中在菌体起始密度、诱导剂加入时机、诱导时间以及诱导温度等条件探索成熟的基础上,采用50L大型发酵罐进行批量发酵。所获菌体蛋白通过饱和硫酸铵粗提和Ni-NTA金属螯和层析获得较纯的表达产物,比较表达量,鉴定纯化后蛋白的抗原活性及生物学活性。结果:用5L及50L发酵罐能获得较高蛋白产量的大肠杆菌,经饱和硫酸铵粗提及Ni-NTA金属螯和层析纯化后可获得抗原性及生物学活性较好的抗体片段。结论:发酵罐发酵大肠杆菌,产量高,所获蛋白含量活性较稳定,为批量生产作了准备。

连翘酯苷对IFN-α和Mx1表达的影响

【目的】探讨连翘酯苷作用于感染PCV2的小鼠模型后,对IFN-α和Mx1表达的影响,以评价连翘酯苷的抗病毒作用。【方法】复制PCV2感染小鼠模型。以(2、4、10mg·mL-1)连翘酯苷分为高、中、低3个剂量组,并设空白对照组和病毒对照组。给药12、24、36h后,分别提取小鼠肺组织总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR检测IFN-α、Mx1 mRNA含量,采用Western blotting检测Mx1蛋白的表达水平。【结果】空白对照组小鼠肺组织中Mx1和IFN-α无表达,病毒对照组少量表达。随着连翘酯苷浓度的升高,IFN-α和Mx1 mRNA水平逐步升高,两者的表达量呈现平行相关;高剂量组中IFN-α和Mx1表达量最高(P<0.001);随着药物作用时间的延长表达量降低,12h时达到最高(P<0.001),其后逐渐下降。【结论】昆明小鼠适于PCV2感染模型的建立。中药连翘酯苷能显著上调IFN-α和Mx1的表达,并在给予高剂量药物后12h发挥显著的抗病毒作用。Mx1蛋白与病毒的感染密切相关,可用于病毒感染的早期诊断,及具有较好的应用前景。

黄芩苷、连翘酯苷对肺微血管内皮细胞分泌IFN-α、IFN-γ的影响

为了研究黄芩苷、连翘酯苷对大鼠肺微血管内皮细胞(pul monary microvascular endothelial cells,PMVECs)分泌IFN-α、IFN-γ的影响,本试验以体外培养的PMVECs为模型,用ELISA法检测这2种中药成分在不同浓度、不同时间点诱导PMVECs分泌IFN-α和IFN-γ的量。结果表明,黄芩苷在10μg/mL,24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量均最高,连翘酯苷分别在20μg/mL、12 h时和5μg/mL、24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量最高。这一结果为体外筛选诱导PMVECs表达干扰素的中药成分提供了参考,为进一步研究中药成分的抗病毒机理奠定了基础。

连翘酯苷对鸡IFN-α和JAK-STAT信号通路相关因子的影响

【目的】探讨连翘酯苷作用于鸡胚肾(CEK)细胞后,IFN-α的表达变化及JAK-STAT通路相关因子mRNA的表达变化,及连翘酯苷对IFN-α和JAK-STAT信号通路的影响。【方法】将连翘酯苷设为3个浓度(100、200和400μg.mL-1),采用荧光定量RT-PCR,检测IFN-α和JAK-STAT通路相关因子的mRNA表达变化;用western blotting检测IFN-α的蛋白表达情况。【结果】与正常组相比,连翘酯苷不仅显著提高了IFN-α的表达量(P<0.05);而且明显上调了STAT1、JAK1、IFNAR1、IFNAR2、IRF1、IRF7的表达。【结论】连翘酯苷能够在鸡胚肾细胞(chicken embryo kidney cells,CEKs)上诱导IFN-α的表达,且能够正向调节JAK-STAT信号通路传导。

羧甲基茯苓多糖对人外周血淋巴细胞分泌IFN-α和IFN-γ的调节作用及中间体制备

用羧甲基茯苓多糖（CMP）预处理人外周血淋巴细胞（HPBL），经200IU／mlIFN－α启动后，加NDV的促诱生组的α-干扰素（IFN－α）效价比无CMP的常规诱生组高1．2倍；经PHA和／或ConA促诱生组的γ-干扰素（IFN－γ）效价比无CMP的PHA和／或ConA刺激常规诱生组高0．5倍（P＜0.01），尤以CMP＋PHA＋ConA促诱生的IFN－γ效果最佳。说明CMP具有IFN－α和IFN－γ促诱生效应（P＜0．01）。用CMP促诱生的IFN－α和IFN－γ中间体经各项指标检测不仅IFN－α和IFN－γ效价高，而且可达到生物制剂药用标准，经临床试验证明安全有效。

尖锐湿疣患者IL-2、sIL-2R、IFN-γ和IFN-α水平的检测

目的 : 研究和探讨白介素 2 (IL- 2 )、可溶性白介素 2受体 (sIL - 2R)、α干扰素 (IFN -α)和γ干扰素 (IFN -γ)等细胞因子在尖锐湿疣发病中的作用。方法 : 采用双抗体夹心ELISA法对 10 6例初发尖锐湿疣 (CA)患者血浆和疣体组织中IL - 2、sIL- 2R、IFN -α和IFN -γ水平进行检测。结果 : CA患者血浆和疣体组织中IL- 2、IFN -γ水平明显低于对照组 (P <0 .0 1) ,sIL - 2R水平明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,但血浆和疣体组织中IFN -α水平均与对照组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 : CA患者存在全身和局部细胞免疫功能障碍 ,且病期越长越明显。

IFN-α对宫颈癌细胞MHC-I类链相关蛋白A表达的上调作用

目的:观察IFNα对宫颈癌细胞MHCI类链相关蛋白A(MICA)表达及功能的影响。方法:以IFNα诱导宫颈癌细胞系HeLa和Caski后,用半定量RTPCR和免疫组化染色法观察诱导前后MICAmRNA和其蛋白表达的变化,用MTT比色法检测诱导前后宫颈癌细胞对外周血NK细胞杀伤敏感性的变化。结果:经IFNα诱导后,HeLa和Caski细胞中MICAmRNA和其表面MICA蛋白的表达水平均明显上调,并呈一定的时间和剂量依赖关系。NK细胞对MICA表达较高的HeLa细胞的杀伤活性,明显高于对MICA弱表达的Caski细胞。经1×106U/LIFNα诱导3d后,两种细胞对NK细胞杀伤的敏感性均明显增强(P<0.01)。结论:IFNα可上调MICA在肿瘤细胞表面的表达,并可增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。

IFN-α和IFN-γ逆转MR2细胞维甲酸耐药的实验研究

目的:探讨IFN-α和IFN-γ与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合逆转MR2细胞对ATRA耐药的可能性及其机制。方法:IFN-α、IFN-γ及ATRA单独或两种IFN分别与ATRA联合作用于对ATRA耐药的细胞株MR2后,采用MTT比色法检测细胞的增殖,用光镜观察、NBT还原实验及流式细胞仪检测细胞的分化,用间接免疫荧光法检测早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白的表达。结果:两种IFN均能抑制MR2细胞的增殖;IFN与ATRA联合应用时抑制作用更加显著;但两种IFN无论是单独应用还是与ATRA联合应用,二者之间均无统计学意义(P>0.05)。两种IFN也能诱导MR2细胞发生一定程度的分化;二者分别与ATRA联合应用时作用更加显著,但IFN-γ+ATRA组诱导MR2细胞分化的作用明显强于IFN-α+ATRA组(P<0.05)。两种IFN都能诱导PML蛋白的表达。结论:IFN-γ与ATRA联合应用逆转MR2细胞对ATRA耐药的作用强于IFN-α与ATRA的联合,可能与IFN-α和IFN-γ信号传导途径的不同有关。

惠阳胡须鸡IFN-α基因的克隆 表达和重组蛋白的抗病毒活性圆二色性分析

IFN-α是一种具有很强抗病毒活性的细胞因子。从惠阳胡须鸡肝脏克隆了IFN-α基因,为新的亚型。将IFN-α成熟肽与毕赤酵母pPICZαA连接,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后确定目的基因无突变并且插入方向正确,将重组质粒转化到GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达,重组IFN-α分子量约为35kD,表达量达到了0.307mg/ml,在CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性为3.2×106U/mg。圆二色实验结果表明IFN-α重组蛋白中含有53.2%α螺旋、3.1%β折叠、10.6%转角和33.1%无规谱卷曲,属于全α型蛋白。结果表明,采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-α,并首次证实鸡IFN-α属于全α型蛋白。

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素(DuIFN-α)并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a+连接后转化到BL21(DE3)获得工程菌BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒(VSV)、鸭瘟强毒(DPV)活性进行研究。结果表明:BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α经0.4mmol/L IPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37 ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质(Ni-MIAC)进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12 800 U/mg;利用定量PCR检测到15 U/mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN-α的临床应用提供试验数据。