高产L-丙氨酸大肠杆菌细胞工厂的构建与发酵优化

L-丙氨酸作为最小的手性化合物之一,被广泛应用于食品、医药和日化领域。目前,微生物法生产L-丙氨酸存在发酵周期长,生产强度低等问题。为此,通过强化前体供给、启动子工程和转运工程等代谢工程策略,构建高产L-丙氨酸的大肠杆菌细胞工厂。进一步通过生化工程策略优化L-丙氨酸生产工艺,提高L-丙氨酸大肠杆菌细胞工厂的生产性能。结果:过表达gapA(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)强化前体丙酮酸供给,使L-丙氨酸产量和转化率分别提高了5.1%和15.6%。启动子工程优化gapA表达,使L-丙氨酸产量和转化率进一步提高到18.3 g/L和0.55 g/g。过表达L-丙氨酸外运蛋白(AlaE),增加L-丙氨酸转运,使L-丙氨酸产量提高到20.4 g/L。生化工程策略优化培养基组分,得到最佳碳源为葡萄糖40 g/L,最佳氮源为(NH4)2SO425 g/L。最佳发酵条件为:接种量15%,10 h转厌氧发酵和变速补料发酵。5 L发酵罐发酵36 h,大肠杆菌菌株W-135 L-丙氨酸产量为127.2 g/L,转化率为0.83 g/g,生产强度为3.53 g/L/h,比优化前分别提高了64.3%,50.9%和64.2%。本研究利用系统代谢工程和生化工程策略,构建了发酵周期短和发酵工艺简单的L-丙氨酸高产菌株,为L-丙氨酸的工业化生产提供了理论基础。

HPLC法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中L-丙氨酸的含量

建立测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中L-丙氨酸含量的反相高效液相色谱法。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XBridge shield C18,4.6 mm×250 mm,5μm)的色谱柱,流动相为乙腈-0.02 mol/L辛烷磺酸钠(用磷酸调节pH至2.5)(V∶V=25∶75),流速0.5 mL/min,检测波长210 nm,柱温30℃。定量限为0.72μg/mL(相当于样品浓度的0.024%),检测限为0.24μg/mL。L-丙氨酸在0.72~225μg/mL浓度范围内,线性方程为Y=619.7733X-157.8515,r=1.0000>0.999。回收率为100.8%~104.9%(RSD<10.0%,n=9)。该方法操作简便、专属性强、灵敏度高,可有效检出L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中杂质L-丙氨酸的含量。

系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-丙氨酸

L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等领域。目前,L-丙氨酸主要通过大肠杆菌来生产,开发安全、工业稳定的谷氨酸棒杆菌生产菌株具有重要的意义。该研究筛选了外源丙氨酸脱氢酶,在不以其他氨基酸为氨基供体的条件下高效率合成L-丙氨酸。强化非磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖摄取途径,极大地促进了细胞的生长和L-丙氨酸的合成。引入异源Entner-Dondoroff途径,通过4步反应即可实现糖酵解途径10步反应供应前体物丙酮酸,进一步提高了L-丙氨酸的产量。此外,为了避免抗生素的使用和保证菌株的遗传稳定性,将关键基因整合到基因组上。最终工程菌株在5 L发酵罐发酵48 h产生104 g/L L-丙氨酸。该研究为利用谷氨酸棒杆菌工业化生产L-丙氨酸奠定了基础,同时为其他丙酮酸族产品的代谢工程研究提供了参考。

大肠杆菌胞内L-丙氨酸响应型启动子的筛选与表征

该研究通过对L-丙氨酸压力下大肠杆菌的转录组进行分析,利用mKate荧光蛋白进行表征,筛选响应L-丙氨酸的启动子元件。转录组筛选了ArgK、FlgG、GlgP、CpxP、BetA、GlpA、KdpB、PulG、LivH和YhfX十个在L-丙氨酸压力下转录水平显著提高的基因,并将基因前500 bp潜在的启动子片段与荧光报告蛋白基因m Kate融合,筛选得到特异性响应L-丙氨酸浓度的启动子PAla-7。结果表明,PAla-7启动子在10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L和60 g/L L-丙氨酸诱导后的相对荧光强度分别增加了49%、122%、181%、275%、432%和705%,表明PAla-7启动子在L-丙氨酸质量浓度0~60 g/L范围内有着良好的灵敏性。选择11种常见氨基酸诱导PAla-7启动子表达,只有L-丙氨酸在诱导质量浓度从10 g/L增加到20 g/L时,相对荧光强度增加了52.4%,表明PAla-7启动子是特异性响应L-丙氨酸的启动子。

L-丙氨酸乙酯还原反应的研究

对L-丙氨酸乙醣的还原方法进行了研究,采用的还原剂有NaBH4,KBH4,KBH4复合还原剂,金属钠,BER树脂,铜铬氧化物,骨架镍等。NaBH4的还原效果优于KBH4。考察了NaBH4还原L-丙氨酸乙酯的影响因素,优化最佳工艺条件为n(NaBH4): n(L-丙氨酸乙酯)投料比2:1,用水作溶剂,室温下反应4h,收率为84.7%。添加ZnCl2,AlCl3和LiCl能提高KBH4还原活性,其中ZnCl2的效果较好,收率可达60.2%。

氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸

用具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌构建固定化细胞,并对DL-丙氨酸进行酶拆分进行了实验研究。考察了温度、pH、底物浓度、金属离子和时间对酶促反应的影响。确定了氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸中酶促反应的最佳工艺条件:pH=7.5,温度50℃,反应时间6h,Co2+离子浓度5×10-4mol/L,在该条件下,D-丙氨酸产率为87.2%,光学纯度为98.0%。

L-丙氨酸螯合铜(Ⅱ)的合成研究及表征

以L-丙氨酸、新制氢氧化铜粉末为原料,合成了L-丙氨酸螯合铜。运用正交实验法获得了最佳反应条件,L-丙氨酸和氢氧化铜物质的量之比为2∶1的混合物在75℃下,pH=6.0的环境中,反应3 h可以得到产率为69.3%的产物。并用EDTA滴定法测定络合物中铜元素的含量,用化学分析和红外光谱分析对其进行结构确认。

L-丙氨酸-N-羧基-环内酸酐的合成及其聚合研究

丙氨酸的四氢呋喃悬浮液在0℃下缓慢通入过量的干燥光气后升温至30℃合成得到了L 丙氨酸 N 羧基 环内酸酐(L Ala NCAn),研究了L Ala NCAn的开环聚合反应以及反应过程中溶剂、温度、引发剂及用量对聚合物特性黏度的影响。利用红外光谱确认了所得单体和聚合产物。用硝基苯作溶剂,三乙胺作引发剂,所得聚合物特性黏度为[η]=0 83dL/g。考虑到强酸对生物高分子的降解作用,实验中测定了二氯乙酸(DCA)对聚合物特性黏度的影响,结果发现二氯乙酸对聚丙氨酸特性黏度无影响。

手性分子中的宇称破缺:D-和L-丙氨酸的变温中子结构研究(英文)

利用单晶的中子衍射研究295K和60K时丙氨酸对映体的结构特征以及由D到L构型转变的可能性.中子衍射数据揭示了变温过程中产生的晶格扭曲和NH3+的扭转.通过分析宇称破缺能差EPV随二面角及扭角的变化,肯定了D-丙氨酸能量高于L-丙氨酸的结论.降温过程中D-和L-丙氨酸的弱氢键的行为的差异表明,可能是由于电弱相互作用宇称不守恒所引起.丙氨酸中子结构再次证实Cα-H…O氢键的存在.然而,比较295K和60K(高于和低于丙氨酸相变温度250K)的中子衍射结构数据,表明并没有发生D型到L型的构型转化,这意味着Salam相变不是传统意义的结构相变.

中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸

采用中空纤维膜反应器 ,利用假单胞菌P dacunhaeDQ p1转化L 天冬氨酸生成L 丙氨酸 ,最适pH6 0 ,最适温度 3 0℃ ,EDTA和Tween 80对细胞产酶有促进作用 ,游离细胞半衰期为 93h。采用对流扩散式中空纤维膜反应器转化L 天冬氨酸生成L 丙氨酸 ,转化率超过 90 %。

甘氨酸、L-丙氨酸和L-丝氨酸在尿素水溶液中的体积性质

蛋白质的折叠与解折叠、稳定性、变性行为和酶的活性等都受到环境中其它各种物质影响[1]. 作为蛋白质模型分子, 氨基酸在混合溶液中的热力学研究近年来引起了广泛重视[2,3]. 尿素在生物体系中的独特地位主要表现在: 它是水结构的破坏者[4], 同时又是许多球状蛋白的变性剂[5]. 然而, 尿素对球状蛋白的变性作用尚未达成共识[6].

用固体高分辨NMR研究聚(L-丙氨酸)-聚乙二醇单甲醚双嵌段共聚物的微相结构与链段运动

利用固体高分辨 1 3 C CP/MAS及二维 WISE核磁共振技术研究了聚 (L-丙氨酸 ) -聚乙二醇单甲醚双嵌段共聚物 (MPEG-b-PLA)在固态下的微相结构和链段运动行为 .结果表明 ,聚乙二醇链段在形成嵌段共聚物后结晶度明显下降 ,同时存在晶区和非晶区 ,从而表现出两种不同的运动状态 .而聚乙二醇链段的引入对聚 L-丙氨酸链段影响不大 ,嵌段共聚物中聚 L-丙氨酸链段高度结晶 ,同时含有大量的α螺旋结构 ,分子链运动严重受限 ,估计聚 L-丙氨酸链段的相区尺寸很小 .

家蚕丝素凝胶固定化细胞生产L-丙氨酸的研究

把家蚕丝素制成丝素溶液,加入工程菌混匀凝固后用戊二醛交联固定,制成固定化细胞丝素凝胶,利用工程菌把底物L天门冬氨酸转化成L丙氨酸。实验结果表明,通过控制底物的流速,可使转化率达到96%以上,在转化率为96%时达到最大转化效率,产量为3.42g/h。连续使用1个月转化原活力仍保持在92%以上。

L-丙氨酸掺杂下ZTS晶体(100)面台阶动力学实时研究

利用光学显微镜对L-丙氨酸掺杂下ZTS晶体(100)面台阶推移进行了实时观察。测量了不同掺杂浓度、过饱和度及生长温度下的台阶平均推移速度。实验结果表明:随掺杂浓度的增加,台阶平均推移速度先增加后减小,在掺杂浓度为2mol%时,台阶平均推移速度最大;而随过饱和度的增加,台阶平均推移速度线性增加。计算了台阶动力学系数与单台阶的活化能,得到掺杂后,台阶动力学系数增大,单台阶活化能减小。运用台阶动力学系数的定义,计算得到掺杂与未掺杂ZTS晶体台阶活化能的范围。同时用红外光谱实验分析了L-丙氨酸在ZTS晶体生长过程中进入晶格,进而影响台阶推移速度。

L-丙氨酸掺杂下ZTS晶体法向生长动力学及化学侵蚀研究

通过对L-丙氨酸掺杂下ZTS（100）、（010）及（001）面法向生长速度的研究发现,各晶面法向生长速度随过饱和度的增加而线性增加;随掺杂浓度的增加,（100）面的法向生长速度先增大后减小,而（010）及（001）面的法向生长速度先减小,接着增大,然后又减小。分析表明（100）面以位错生长机制为主,（010）及（001）面以连续生长机制为主。利用光学显微镜在侵蚀后的（100）面观察到矩形位错蚀坑,蚀坑密度为33～308 mm-2;掺杂浓度为1%（摩尔分数）时,蚀坑密度最小。

基于L-丙氨酸的手性聚酰胺酰亚胺的合成与表征

通过L-丙氨酸与均苯四甲酸二酐的缩合反应得到手性酰亚胺,再与二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)聚合制备出基于L-丙氨酸的手性聚酰胺酰亚胺。用傅立叶红外光谱仪(FT-IR),核磁共振(1H-NMR)表征了聚合物的结构。用差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TG)研究了共聚物的结晶性能和热稳定性,同时对聚合物的溶解性能进行了探讨。研究表明,实验达到了预期目标,熔点Tm为357.6℃,失重5%的分解温度Td5为215℃,表明具有良好的耐热性能。常温下能溶于N-甲酰二甲胺,二甲基乙酰胺,二甲基亚砜,N-甲基吡咯烷酮,表明具有优异的溶解性能。

L-丙氨酸在食品工业中的应用潜力

作为一种兼具甜味与鲜味的氨基酸,L-丙氨酸已被批准进入食品增味剂行列,它可以改善食品风味,提高食品营养价值,潜藏着巨大的应用市场。文章介绍了L-丙氨酸在食品中的增味作用,探讨了它在食品工业中的应用潜力。

稀土元素L-脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸四元固态配合物的合成与表征

合成了6种稀土与L-脯氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸四元固态配合物[RE(Pro)(Gly)2(Ala)2]Cl3·C2H5OH,并以热谱、红外光谱、核磁共振氢谱、质谱进行了表征。

新型L-丙氨酸尾式卟啉锌配合物的合成及其傅里叶变换红外光谱研究

合成了一种新型 L-丙氨酸尾式卟啉及其锌配合物 ,测试并研究了它们在 4 0 0 0— 4 0 0 cm-1范围内的傅里叶变换红外光谱 ,对主要谱带进行了经验归属。研究发现 ,在锌配合物的谱带中 3316 .9cm-1、96 5 .8cm-1和 72 8.9cm-1谱带消失 ,而在 10 0 2 cm-1处出现了四苯基卟啉衍生物所特有的卟啉环骨架的强吸收带 ,这是 Zn( )离子与氨基酸尾式卟啉形成配合物的显著特征。卟啉环的结构敏感谱带出现在1470、144 2、 135 0、 10 0 2、994和 796 cm-1处。

L-丙氨酸在LiNO_3,NaNO_3,KNO_3和NaClO_4水溶液中的体积性质

利用Anton Paar DMA 55精密数字密度计测定了L-丙氨酸在LiNO3,NaNO3,KNO3和NaClO4水溶液中的密度,计算了L-丙氨酸的表观摩尔体积、极限偏摩尔体积、迁移偏摩尔体积、理论水化数和体积作用系数.根据静电相互作用和结构水合作用模型讨论了阴离子和阳离子对迁移偏摩尔体积的影响.结果表明,L-丙氨酸在四种含氧酸盐水溶液中的迁移体积均为正值,并且随着盐浓度的增大而增大.L-丙氨酸两性离子端基和阴阳离子间的静电作用对迁移体积的贡献是主要的.静电作用削弱了两性离子带电中心对周围水分子的电致收缩效应,造成了理论水化数随溶液浓度的增加而减小.L-丙氨酸在NaNO3,KNO3和NaClO4水溶液中迁移体积的不同主要是由于静电作用的不同引起的,在LiNO3水溶液中迁移体积的“反常”是由于结构相互作用的影响较大所致.