牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、-278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体,确定了启动子核心区域和主要的调控区域。

猪Nramp1基因多态性与免疫功能的相关性

【目的】探讨Nramp1基因第6内含子多态在大白猪和松辽黑猪(是由杜洛克、长白猪和民猪合成)中的分布及其与猪免疫抗病的关系。【方法】采用PCR-RFLP法对165头大白猪和109头松辽黑猪Nramp1基因第6内含子多态性与免疫功能(中性粒细胞还原力和单核细胞细胞毒百分率)的相关性进行了研究。【结果】两个品种在该位点均存在多态性,品种间、合并基因型间免疫功能差异不大,但同一品种内不同基因型间差异显著;大白猪BB基因型个体的单核细胞细胞毒百分率显著高于AB基因型个体(P<0.05),BB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值极显著高于AB基因型个体(P<0.01),而在松辽黑猪中则是AB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值显著高于BB基因型个体(P<0.05);从断奶到出栏的死亡率分析显示大白猪BB基因型个体死亡率明显低于AB基因型个体,松辽黑猪则是AB基因型个体的死亡率明显低于BB基因型个体。【结论】品种内不同Nramp1基因型与免疫功能间存在着显著相关,Nramp1基因可作为抗病力性状的一个主要候选基因。

合作猪Nramp1基因第六内含子多态性分析

采用PCR-SSCP方法检测了135头合作猪Nramp1基因第六内含子的多态性.结果表明:序列比对分析发现10个新的核苷酸多态位点,其中,转换7个,颠换2个,插入1个;试验群体发现5个基因型,即AA、AB、BB、CC、AC,其中B等位基因为优势等位基因,AB基因型为优势基因型;经χ2适合性检验,该群体处于Hardy-Wein-berg平衡状态(P>0.05);Nramp1基因遗传多态指数中,杂合度为0.617 4,多态信息含量为0.537 3,有效等位基因数为2.613 7.

香猪NRAMP1基因多态性与仔猪腹泻的研究

天然抗性巨噬蛋白1(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)基因是与人、鼠的一些病原微生物(如分支杆菌中的沙门氏伤寒菌等)的易感性和抗性有关的重要候选基因。本研究利用PCR-RFLP技术,分析了香猪的NRAMP1基因第6内含子的NdeⅠ酶切位点的多态性;观测记录哺乳仔猪的腹泻情况,结果发现,NRAMP1基因的第6内含子的NdeⅠ酶切位点在各品种猪表现出丰富的多态性,该酶切位点的基因频率和基因型频率在各猪种中分布趋于一致,香猪不同品系基因型与腹泻指数统计分析结果显示,Ⅰ系、Ⅱ系差异不显著,11世代显著高于10世代。

荷斯坦牛Nramp1基因遗传多态性及其与乳房炎相关性的研究

利用PCR-SSCP技术检测了344头中国荷斯坦牛Nramp1基因exon 11的基因多态性,并分析了其不同基因型与乳房炎及产奶量性状的关系。结果表明:实验群体发现3种基因型AA、AB、BB,其中A等位基因为优势等位基因,等位基因频率为0.767,而B等位基因频率则为0.233。经X^2适合性检验,群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。测序结果显示:扩增片段分别在200 bp(C/G)和254 bp(T/G)存在碱基突变,并导致了氨基酸改变,分别为丙氨酸替换为脯氨酸(A1a356Pro)、亮氨基酸替换为蛋氨酸(Leu374Met)。通过构建最小二乘线性模型,进行Nramp1基因多态性与产奶量、体细胞评分(SCS)的相关性分析表明,AA型个体的SCS最小二乘均值显著低于BB、AB型(P<0.05),而AA型、AB个体的产奶量最小二乘均值显著高于BB型(P<0.01,P<0.05),AA基因型可作为乳房炎抗性的优良基因型。因此,可将Nramp1作为奶牛乳房炎候选基因应用于分子标记辅助选择育种。

中国荷斯坦奶牛Nramp1基因多态性与泌乳性状及产奶量的关联性分析

为寻找与乳房炎相关的分子标记,为荷斯坦牛的抗病育种提供理论基础,试验采用PCR-SSCP技术和测序的方法对宁夏农垦303头中国荷斯坦奶牛的Nramp1基因进行了遗传多态性分析,利用一般线性模型分析Nramp1基因c.200C>G突变对泌乳性状及产奶量影响。结果显示,Nramp1基因c.200C>G突变与乳脂率、日产奶量和体细胞评分值存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)关联。因此,可以把该位点作为中国荷斯坦奶牛体细胞评分、测定日产奶量和日乳脂率的遗传标记进行进一步研究。

NRAMP1基因3’UTR多态性与结核病易感性的研究

目的 研究NRAMP1基因3’UTR多态性与汉族结核病易感性的关系。方法 选取汉族活动性结核病患者147例,正常对照145例,用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphisms)的方法对NRAMP1因基3’UTR进行基因分型,根据基因型对样本分组,经统计学处理,研究3’UTR多态性与结核病易感性的关系。结果 在活动性结核病患者中3’UTR TGTG/TGTG基因型95例(64.6％),TGTG/TGTG缺失基因型50例(34.0％),TGTG缺失/TGTG缺失基因型2例(1.4％),正常对照TGTG/TGTG基因型则为115 例(79.3％),TGTG/TGTG缺失基因型29例(20％),TGTG缺失/TGTG缺失基因型1例(0.7％)。正常对照组TGTG/TGTG基因型明显高于结核病患者(x2=7.79;P<0.01)。研究发现TGTG的等位基因频率为0.85,TGTG缺失的等位基因频率为O.15。结论 NRAMP1基因3’UTR多态性可能与结核病易感性相关,汉族3’UTRTGTG缺失等位基因频率明显高于白种人,可能部分解释汉族比白种人更易患结核病。

斗鸡Nramp1基因多态性与部分免疫指标相关性分析

随机选取同期孵化出雏的漳州斗鸡32只,测定12周龄鸡的部分免疫指标。利用PCR-SSCP技术检测斗鸡Nramp1基因第九外显子的多态性,并对不同基因型与免疫指标进行相关分析。结果显示:斗鸡Nramp1基因第九外显子在C315G、C357T处有2个突变,两处均为同义突变,并检测到3种基因型,不同基因型在异嗜性细胞与淋巴细胞比率(H/L值),Ig M和Ig M含量均呈现出显著差异(P<0.05)。AA基因型的H/L值、Ig G和Ig M含量均显著高于BB基因型,Ig M和Ig G含量与AB型差异显著(P<0.05),其余指标与AB基因型差异不显著。初步研究结果显示,斗鸡AA基因型的综合免疫性能要优于AB和BB型,可作为一种高抗性基因型。

NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的研究

为了研究人类自然抵抗相关巨噬细胞蛋白NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系,研究选取新疆哈萨克族活动性结核病患者213例,新疆哈萨克族正常对照者211人,用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法对NRAMP1基因3′UTR多态性进行基因分型,比较不同基因型及等位基因的频率,经统计学分析,探讨NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系.结果显示,在新疆哈萨克族活动性结核病患者组中NRAMP1基因3′UTR TGTG+/TGTG+基因型138例(64.8%),TGTG+/del基因型63例(29.6%),del/del基因型12例(5.6%);新疆哈萨克族正常对照组TGTG+/TGTG+基因型则为167例(79.1%),TGTG+/del基因型41例(19.5%),del/del基因型3例(1.4%).新疆哈萨克族结核病患者组TGTG+/del基因型和del/del基因型频率明显高于新疆哈萨克族正常对照组,差异有统计学意义(χ2=10.8,P<0.01);在新疆哈萨克族结核病患者组的TGTG+等位基因频率为79.6%,del等位基因频率为20.4%,新疆哈萨克族正常对照组中TGTG+和del等位基因频率分别为88.9%和11.1%,del等位基因在新疆哈萨克族结核病患者组中的分布频率高,差异有统计学意义(χ2=13.7,P<0.01).研究结果提示TGTG缺失等位基因可能是新疆哈萨克族结核病的易感基因,携带TGTG+/del和del/del基因型的新疆哈萨克族人群可能更易患结核病.

3个外种猪Nramp1基因多态性研究

采用PCR-RFLP方法,对3个外种猪群Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了检测。结果表明,在3个外种猪群中均仅检测到AB和BB2种基因型,其中AB基因型为优势基因型,BB基因型为数极少,未检测到AA基因型。卡方检验结果表明,3个外种猪群该位点均处于遗传不平衡状态(P<0.01)。群体中该位点杂合度较高、纯合度较低,具有中度遗传多态性,可在后续的育种方案中实施分化选择和培育,为抗病育种提供遗传素材。

NRAMP1基因DNA多态性与海南黎族人结核病易感性的研究

目的探讨自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1)基因D543N和3′UTR位点多态性与海南黎族人结核病易感性的关系。方法采用病例对照研究设计,共有130例肺结核病例和233例对照纳入本研究,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法检测入选人群NRAMP1基因中D543N和3′UTR位点的多态性,并对结核病相关危险因素进行问卷调查,进行单因素和基因频率的分析。结果对所有研究对象进行D543N和3′UTR两个多态性位点的基因分型,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型病例组频率显著高于对照组,OR值分别为5.531(2.649-11.549)和0.181(0.087-0.378);D543N位点各基因型频率在病例和对照组中的频率无显著性差异;同时对4个相关危险因素进行了单因素分析,结果性别、酗酒两个因素在病例组和对照组中有显著性差异,OR值(95%CI)分别为3.937(2.459-6.304)和2.435(1.507-3.937),在多因素分析中,调整了性别、吸烟、酗酒3个因素后,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型仍与肺结核显著相关,OR值(95%CI)分别为5.140(2.394-11.034)和4.929(2.769-8.775)。结论NRAMP1基因3′UTR位点多态性可能是海南黎族人结核病的易感因素,D543N位点多态性与海南黎族人结核病的发生无关。

藏猪NRAMP1基因的定量表达研究

采用半定量和定量PCR方法对藏猪的NRAMP1基因在脾脏等10个组织中的表达进行了研究.结果显示,该基因在所研究藏猪的组织中均得以表达,无组织表达特异性;定量PCR的结果证实该基因在不同组织中的表达量有很大的差异,其中,在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低,两者之间相差77倍,10个组织的平均表达量为3233拷贝/μg cDNA;NRAMP1基因在10个组织表达丰度从高到低的顺序为:脾脏、大脑、肺脏、回肠、肾脏、颌下淋巴结、结肠、心脏、肌肉和肝脏.

徐州荷斯坦牛NRAMP1基因多态性与产奶量通径分析

采用PCR技术研究了徐州150头荷斯坦牛NRAMP1基因3′UTR非编码区域211 bp的DNA多态性,并对其与奶牛产奶量、乳房炎检出率、乳汁pH值等性状进行了相关及通径分析。结果表明,在这个区域出现了复杂的DNA多态性,有效等位基因数、固定指数、多态信息含量分别为20.488、-0.204 8和0.950,该群体处于Hardy-W e inberg平衡。基因型频率与奶牛产奶量呈正相关,且为直接作用;乳汁pH值与产奶量呈正相关,但间接作用较大;乳房炎检出率与奶牛产奶量呈正相关,直接发挥作用。

BCL10、Nramp1基因多态性与大白仔猪断奶前腹泻关联分析

为研究大白猪BCL10基因和Nramp1基因的单核苷酸多态性,并寻找与大白仔猪断奶前腹泻相关的分子标记,构建490头大白仔猪群体,对仔猪断奶前腹泻情况进行统计,利用PCR-RFLP法检测BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点多态性,同时与腹泻频率、腹泻指数和部分生长性状进行关联分析。结果显示:大白仔猪断奶前腹泻率为32.0%,重度腹泻个体的21日龄平均断奶重比正常个体低13.0%,日增重低16.2%,而且大白仔猪在7~11日龄和17~21日龄存在2个断奶前腹泻小高峰。仔猪腹泻粪便病原检测结果表明,22.5%的样本检出为沙门氏菌感染,17.5%的样本检出为致病性大肠杆菌感染。关联分析结果表明:BCL10基因多态性与初生重相关联(P<0.05),TT型个体初生重大于TC型个体,差异显著(P<0.05);BCL10基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均表现为TT>TC>CC,CC与TC之间差异显著(P<0.05),CC与TT之间差异极显著(P<0.01);Nramp1基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均为AA、AB型大于BB型,且AA型与BB型差异显著(P<0.05),AB型与BB型差异极显著(P<0.01)。研究结果表明,BCL10基因和Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响,Nramp1基因与猪沙门氏菌感染导致的腹泻有关,BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。

NRAMP1基因多态性与重庆市汉族人群肺结核易感相关性研究

目的:研究(Natural-resistance-associated macrophage protein1,NRAMP1)NRAMP1基因rs17235409A/Gr、s17235416TGTG/(-)位点多态性与重庆地区汉族人群肺结核易患性的关系。方法:采用病例对照研究。按肺结核诊断标准(GB15987-1995),在重庆市、重庆市沙坪坝区结核病防治所选取初治、肺结核痰涂片阳性的汉族肺结核确诊病例100例;对照为同样诊断标准排除肺结核等疾病的汉族正常人,共106例。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性的方法对NRAMP1基因rs17235409A/G、rs17235416TGTG/(-)进行基因分型,用检验分析这2个位点多态性与结核病易患性的关系,数据分析利用SAS8.2软件进行。结果:病例组中NRAMP1基因rs17235409 GG、GA+AA基因型频率分别为67.00%、33.00%;对照组中分别为87.34%、12.26%,组间分布差异有统计学意义χ,2=12.694 8,P<0.05。具有GA或(和)AA基因型的个体患肺结核的OR为3.523 5,OR95%CI为1.762 3～7.044 9。rs17235416 TGTG/(-)多态性基因频率在病例和对照组间有显著性差异(χ2=7.377 3,P<0.05)。拥有TGTG/(-)+TGTG(-)/(-)基因型的个体的OR值为2.340 2,OR95%CI为1.267 0～4.322 2。结论:NRAMP1 rs17235409A/G、NRAMP1rs17235416TGTG/(-)2个位点多态性均与重庆市汉族人群肺结核易患性相关,可能是重庆地区汉族人群肺结核易患性的影响因素。NRAMP1rs17235409A等位基因r、s17235416 TGTG(-)等位基因可能是重庆市汉族人群肺结核发生的危险因素。

NRAMP1基因研究进展及其在抗病育种中的应用

抗病性能是当前畜禽育种的重要目标性状。NRAMP1蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要免疫功能,对畜禽机体抗病力影响较大。作者综述了NRAMP1基因的结构、功能、作用机制及其与抗病力的关系,并探讨了NRAMP1基因作为畜禽抗病候选基因及其应用于抗病力分子标记辅助选择的可行性。

马立克病病毒对鸡NRAMP1和TNFSF13B基因转录水平的影响

旨在探究马立克病毒(MDV)感染后,不同鸡体内NRAMP1和TNFSF13B基因的转录差异;比较不同鸡种对MDV的抗病性差异。选取山东省优良地方鸡种济宁百日鸡、汶上芦花鸡、寿光鸡作为研究对象,以SPF白来航鸡为对照。随机抽取100枚受精卵,在同一孵化箱内同时进行孵化、育雏和马立克病毒的人工攻毒,攻毒后7~90d,选取染病且存活的鸡,采集肝、脾等组织,进行荧光定量PCR检测。结果表明:在7日龄攻毒后90d的脾组织中,汶上芦花鸡与寿光鸡和SPF鸡NRAMP1基因的mRNA转录量差异显著(P<0.05);在7日龄攻毒的肝组织中,济宁百日鸡的TNFSF13B基因mRNA的转录量显著高于其余3个鸡种(P<0.05)。结果提示:NRAMP1作为家禽抗马立克病的候选基因,在感染了马立克病毒90d后,转录量显著上调,可能是其增强鸡对MDV的抵抗力的重要因素;TNFSF13B作为肿瘤相关抑制基因,在济宁百日鸡中的转录量最高,济宁百日鸡作为肿瘤发生率最高的鸡种,在最后存活的抗性鸡中转录量高。

鸡NRAMP1基因抗沙门氏菌的研究进展

沙门氏菌病给畜禽产业带来了严重的危害,而鸡NRAMP1基因能在抵抗沙门氏菌的侵害中发挥重要的免疫功能。综述了NRAMP1基因的结构、功能、作用机制及其在抵御沙门氏菌的研究进展。

家兔组织器官中Nramp1基因表达差异研究

本研究旨在检测家兔Nramp1基因mRNA在不同组织中的表达水平,为进一步阐明家兔Nramp1基因的生物学功能提供有用的方法和信息。根据GenBank中家兔Nramp1基因序列设计引物,采用基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR对家兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、盲肠、回肠、淋巴结、肌肉、脂肪和大脑中Nramp1表达水平进行了定量分析。结果表明,Nramp1基因在肺脏组织中表达量最高,胃组织中最低,而在肌肉和盲肠组织中不表达。研究结果说明家兔Nramp1表达具有一定组织器官特异性。

人类NRAMP1基因与结核分枝杆菌的易感性

20多年前在对小鼠的疾病易感性研究中发现,有一基因对疾病的易感性起决定性的作用,近年来研究发现NRAMP1(Natural-resistance-associtted macrophage protein1,自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1)是主要的侯选基因,NRAMP1的结构显示具有膜转运蛋白的典型特征,它存在于吞噬小体膜上,它的主要功能是通过改变含有微生物的吞噬体液泡内环境来控制其复制,从而消灭胞内菌.国外已做了大量研究证实NRAMP1基因与麻风病、结核病的感染有明显的关联,国内也已对汉族人NRAMPI基因进行了研究,同样证实NRAMP1基因的某些位点的多态性与结核的发病相关,黎族是中国55个少数民族中唯一分布在海南省的少数民族,据调查显示黎族人痰涂片检出率高于同期汉族人的9.9%[25]的平均水平,除了结核病的发生与环境因素有关外,是否也与NRAMP1基因某些位点的多态性有关呢?值得我们研究。