O型口蹄疫抗体金标检测试纸条判定标准的确立

本试验旨在迅速、准确检测口蹄疫阴性血清和阳性血清,确立O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准。通过3批次O型口蹄疫抗体金标检测试纸条,对180份猪、牛、羊口蹄疫阴性血清,197份猪、牛O型口蹄疫弱阳性血清,317份猪、牛、羊O型口蹄疫阳性血清,223份牛Asia 1、A型口蹄疫阳性血清,600份田间血清样品进行检测,同时用O型口蹄疫液相阻断ELISA和O型口蹄疫正向间接血凝2种方法检测相同的血清样品。对3种方法检测的结果进行分析,并且将试纸条的检测线和质控线的显色情况与O型口蹄疫液相阻断ELISA的抗体滴度相比较。确立了试纸条的诊断标准:试纸条抗体滴度1∶2-为口蹄疫抗体阴性;试纸条抗体滴度1∶8+为O型口蹄疫阳性血清。根据试纸条的显色结果与液相阻断ELISA的结果的关系,绘制了比色卡。试纸条的判定标准检测血清结果与液相阻断ELISA和正向间接血凝结果分别进行统计学分析,试纸条与液相阻断ELISA和正向间接血凝相关性分别为y=1.142x+0.7421,y=1.1845x+0.8623;相关系数(r)分别为0.9221和0.9033。结果显示,O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准的确立和比色卡的绘制,实现半定量分析,更加迅速、准确,适于实验室、基层兽医站和养殖场使用。

O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。

O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒单抗制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原,并制备单克隆抗体,为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,用间接ELISA方法筛选阳性细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得2株能够稳定分泌特异性针对O型口蹄疫Cathay株病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为10E6与11C7。叠加试验表明,两株单抗的叠加率为49.45%,识别不同的抗原表位。间接ELISA和IFA试验显示,两株单抗与O型口蹄疫Cathay株病毒具有良好的反应性。单抗特异性检测结果表明,2株单抗均能特异性识别Cathay株口蹄疫病毒,不与其他口蹄疫病毒毒株交叉反应。抗体亚型鉴定结果显示,10E6单抗的轻链为Kappa链,11C7单抗的轻链为Lamda链,两株单抗重链类型均为IgG2a。结果表明,本研究成功制备了两株特异性结合O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒的单克隆抗体,两株单抗均具有良好的反应性与特异性。应用两株单抗建立O型口蹄疫Cathay病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好,为O型口蹄疫Cathay毒株的快速诊断防控与研究建立了基础。

2017-2023年眉县猪、牛和羊O型口蹄疫免疫抗体监测与分析

为获知近年来眉县猪、牛和羊口蹄疫的免疫情况,对2017-2023年间全县8个镇(街)共7059份猪、牛和羊血清样品进行抗体检测,并从不同年份、不同季节、不同区域等角度对当地口蹄疫免疫抗体合格率进行比较分析。结果显示,2017-2023年眉县全域猪、牛和羊的口蹄疫免疫抗体合格率均高于70%。其中,牛和羊O型口蹄疫的免疫抗体合格率最高达100%且保持稳定,而猪O型口蹄疫免疫抗体合格率在个别镇(街)较低,低至45%,说明该县近7年间猪、牛和羊口蹄疫免疫抗体合格率总体达到农业农村部的标准(>70%),但针对猪应立即调整现行的免疫流程,加强集中免疫和日常补充免疫,以建立起县域有效的动物免疫保护屏障,确保养殖业健康发展。

2021—2023年兰州新区羊A型、O型口蹄疫免疫效果评估

为科学有效地掌握兰州新区羊口蹄疫疫苗免疫情况,2021—2023年在该辖区采集羊血清2340份,采用液相阻断ELISA法检测A型、O型口蹄疫抗体水平并统计结果,为后期补免工作提供数据依据。结果表明:2021—2023年兰州新区春秋季羊A型口蹄疫免疫抗体合格率分别为75%、70%,78%、89%,70%、78%;羊O型口蹄疫免疫抗体合格率分别为82%、75%,84%、83%,71%、70%;羊A型、O型口蹄疫免疫抗体合格率均≥70%。综上所述,兰州新区羊口蹄疫免疫效果整体良好,但是部分指标仅勉强合格,需要加强补免工作,做到应免尽免,有效落实以免疫为主的综合防控措施,切实做好羊口蹄疫疫情预防工作,推动兰州新区羊产业高质量发展。

猪塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法中阳性参考品的制备

为制备猪塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒(FMDV-O)阳性质控品,根据选择的目的基因片段,设计阳性参考品序列,通过基因拼接技术和装甲RNA技术,制备含有口蹄疫O型病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,用来作为塞内卡病毒(SVA)和O型口蹄疫病毒(FMDV-O)的阳性参考品。结果表明,该阳性质控品无生物传染性,可以真实模拟病毒粒子结构,耐受DNaseI及RNaseA,稳定性高,在-70℃保存18个月,荧光RT-PCR检测结果均无显著差异。本试验制备的含有猪O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒目的基因的装甲RNA病毒样颗粒,可以作为SVA和FMDV-O双重荧光RT-PCR检测方法中进行质量控制的阳性参考品。

牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的偶蹄类动物传染病,具有传播速度快、感染范围广、危害严重等特点,其中O型口蹄疫是引起口蹄疫的主要病毒类型之一。在疑似病例诊断和鉴别诊断过程中,牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测可以作为一种快速、准确的辅助诊断方法,通过检测待检样本中的特异性抗体水平是否高于临界值,并结合临床症状和其他检查结果综合分析可作出准确判断,同时通过对历史数据的分析,可以预测疫情的发展趋势和流行规律,为制定科学有效的防控策略提供依据,这对于牛羊O型口蹄疫的疫情控制具有重要意义。

山羊O型口蹄疫和小反刍兽疫免疫抗体检测分析

为了解元江县山羊O型口蹄疫(FMD-O)和小反刍兽疫(PPRV)疫苗免疫状况,并评估免疫效果,2019—2023年在全县10个乡镇(街道)规模场和散养户中随机采集山羊血清样品,用ELISA法检测免疫抗体。结果显示,不同年份山羊FMD-O/PPRV平均免疫抗体合格率分别为74.43%和86.27%。不同区域山羊FMD-O免疫抗体合格率61.93%~82.72%;PPRV免疫抗体合格率68.07%~92.97%。FMD-O规模场(户)免疫抗体合格率显著高于散养户,差异极显著(P=0.008<0.01);PRPV规模场(户)抗体合格率略高于散养户,差异不显著(P=0.483>0.05)。

特异性转移因子对猪O型口蹄疫免疫抗体水平影响的研究

猪O型口蹄疫是由O型口蹄疫病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病.由于该病传播迅速,发病率高,世界动物卫生组织将其列为必须报告的传染病之一,我国政府也将其归为一类动物疫病.迄今为止,免疫接种是控制口蹄疫的关键措施.当猪场或周边出现口蹄疫威胁时,由于普通免疫需要21 d左右群体才能产生有效保护能力,紧急免疫就显得力不从心,所以急需一种免疫佐剂协同提高免疫保护能力.本研究旨在探讨转移因子和猪O型口蹄疫疫苗联合应用,初免和二次免疫后体内抗体水平的影响.

O型口蹄疫疫苗免疫牛抗体消长动态的LPB-ELISA检测

分别按一次免疫、首免后第15 d加强免疫和首免后第60 d加强免疫程序,对3组试验牛(每组牛20头)用O型口蹄疫疫苗进行了免疫。免疫后不同时间点用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)测定了免疫牛O型口蹄疫抗体效价。结果,首免后第15 d加强免疫牛和第60 d加强免疫牛抗体水平较高,50%保护牛所占比例分别为56.3%和63.1%,完全受保护的牛所占比例分别为34.3%和29.5%。第60 d加强免疫牛的保护率要高于第15 d加强免疫牛和一次免疫牛的保护率。结果表明,首免后第60 d加强免疫是最理想的免疫程序。

O型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗O型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记O型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗O型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有O型FMDV,它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗O型FMDV抗体形成夹心复合物,并在检测带被固定,沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中,53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测,2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实,本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速,具有良好的特异性和敏感性,非常适于基层兽医实验室诊断时使用。

以免疫球蛋白为载体的抗O型口蹄疫病毒基因工程疫苗的构建

以自体免疫球蛋白作为外源抗原的载体来研制疫苗是一条研制安全、高效疫苗的新途径。将猪IgGH链基因中的CDR3区缺失 ,剩余的两个片段分别连接到pBluescriptⅡSK(+)和 pBluescriptⅡKS(+)上 ,其中一片段再与编码FMDVVP1两个拷贝的 141～ 16 0位氨基酸残基和一个拷贝的 2 0 0～ 2 13位氨基酸残基构成的串联片段2 0AA～ 14AA～ 2 0AA的核苷酸片段相连。然后将它们切下与质粒表达载体 pET2 8b相连 ,构建出融合表达质粒pET2 8b FH ,经限制酶酶解及DNA序列分析证明该融合基因各连接点及读框正确。转入大肠杆菌BL2 1(DE3) plysS表达出一分子量为 6 4kD的蛋白质。经ELISA检验证明 ,大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有O型FMDV抗原活性。将该融合蛋白肌肉注射免疫豚鼠和猪 ,攻毒实验表明 ,疫苗pET2 8b FH对豚鼠产生了保护作用 ,保护率为 6 6 % ,对猪也有保护作用。

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒（即CpG DNA）作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果。结果表明：CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍。CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照 与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照（PD504.69）。在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗（50、200μg.头份-1）都比高剂量组（500μg.头份-1）诱导的抗体滴度高,其中50和200μg.头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14~32 d诱导的抗体滴度高达1∶1500,是标准疫苗的4~5倍,而500μg.头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应。研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔。

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病毒(FMDV)(L1～L5)的RNA,用1对通用引物经RT PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段.克隆后通过测序获得其核苷酸序列,分析表明,除L2株外,其余4株(L1、L3、L4和L5)VP1基因的核苷酸序列同源性在96 7%～99 8%,氨基酸序列同源性在99 5%～100%;而L2株与L1、L3、L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82 0%～83 4%,氨基酸序列同源性在89 7%～90 1%.L1、L3、L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86、HKN/1/99、HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在85 0%～99 8%,属于同一基因型;而与L2、F29/CHINA及国外大多数毒株相比,属于不同的基因型,其核苷酸序列同源性仅为41 0%～82 6%.5株毒株中的L1、L3、L4和L5的主要中和抗原位点140～160、200～213位氨基酸序列完全相同,推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性.

O型口蹄疫病毒不同基因型联合RT-PCR检测方法的建立

在比较国内外口蹄疫病毒 (FMDV)流行毒株序列的基础上 ,设计了检测 FMDV的 PCR引物及 O型 FMDV不同基因型即中国型 (Cathay)与乏亚株 (Pan Asia)的二联 PCR引物。在确定单项 RT- PCR反应条件的基础上 ,建立、优化了二联 RT- PCR反应体系和条件 ,并进行了相关病毒检测试验。结果表明 ,建立的检测 O型 FMDV不同基因型中国型与泛亚株的二联 RT- PCR,有效、特异且敏感 ,为 FMD的诊断。

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET 32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础.经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS PAGE和Western blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好.

O型口蹄疫抗体金标试纸盒检测免疫动物抗体效价与攻毒保护关系

本研究目的在于用O型口蹄疫金标试纸条研究免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的对应关系以及免疫牛抗体消长规律。用金标试纸条检测了口蹄疫O型疫苗质量标准规定的牛、羊和猪免疫和攻毒血清抗体效价及不同免疫程序的牛血清效价。结果显示,当牛、猪和羊免疫血清稀释≥1∶8时,试纸条是阳性结果,表示有99%的被免疫动物属于抗体水平保护范围;被检测血清稀释≤1∶2时,是阴性结果,表示被免疫动物抗体水平属于不保护范围;血清稀释1∶2～1∶8时,是阳性结果,表示有50%的被免疫动物属于抗体水平保护范围。牛在首次免疫8周后加强免疫可以获得良好的保护率和保护时间。通过本试验确定了金标试纸条检测免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的关系及牛加强免疫最佳的时间。

嵌合O型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒VLPs载体疫苗的构建

综合运用生物信息学和分子生物学技术,模拟PPV VP2蛋白表面不同Loop区插入O型FMDV VP1蛋白上多表位基因(VP1:21～40、141～160和200～213残基)空间构象,并在VP2 N端引入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE),人工合成嵌合基因并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTA中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV VP1∶PPV VP2,用脂质体法转染Sf9细胞。对rBac-FMDVVP1∶PPV VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用Western-blotting分析,在64 000处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组VP2蛋白能够自主组装成病毒样颗粒。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白PPV∶VP2-FMDV∶VP1具有与全病毒类似的血凝活性。

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP_1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的序列 ,设计并合成了 1对用于扩增整个VP1基因的引物 (5P、P6 )。从细胞培养液或组织中提取总RNA ,通过PT_PCR扩增 ,从F2 9株、O3I3株和T5 0 9株中均获得了 1条约 740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收 ,插入到相应双酶切的pUC18质粒中 ,获得了重组质粒。通过PCR鉴定 ,证明重组质粒pUCVP1/F2 9、pUCVP1/O313、pUCVP1/T5 0 9均插入了VP1基因。对上述 3个重组质粒进行测序后分析 ,F2 9强毒株与O3I3、T5 0 9弱毒株相比 ,其核苷酸序列同源性分别为 98.75 %和 99.0 6 % ;因F2 9株核苷酸发生 3个碱基缺失与 1个碱基替换 ,故推导的氨基酸序列同源性分别仅为 44 .13%和 41.32 % ;而T5 0 9株与O3I3株相比 ,其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为 99.37%和 95 .31%。通过序列分析发现 ,本研究的 3个毒株与国内大多数毒株 (包括 1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株 ,除O/A/ 5 8株外 )均属于同一基因型 ,核苷酸序列同源性为 85 %～ 94% ;而与国外毒株相比 ,属不同的基因型 ,核苷酸序列同源性仅为 81%～ 82 %。其推导的氨基酸序列 ,除F2 9株与O/HK/ 93株及 1997年台湾暴发FMDV分离的少数毒株的氨基酸序列同源性仅为 45 %～ 6 3%外 ,本研究的

不同厂家猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫效果监测

为准确掌握投放安徽省的A、B、C、D 4个厂家的猪O型口蹄疫灭活疫苗在实际生产中的免疫效果,2008年秋季至2011年春季,共采集了844个猪场10 439份免疫接种后1个月左右血清样,采用液相阻断ELISA检测了O型口蹄疫抗体滴度。结果显示,4个厂家疫苗的免疫接种效果差异明显,B厂疫苗免疫效果最好,D厂疫苗次之;不同年份疫苗的免疫接种效果差异显著,2010年的疫苗免疫接种效果最好。