polo样激酶1、RNA聚合酶Ⅱ亚基A在人脑胶质瘤中的表达及与预后的关系

目的 探讨polo样激酶1(PLK1)、RNA聚合酶Ⅱ亚基A(POLR2A)在人脑胶质瘤(BG)中的表达及与预后的关系。方法 选取86例BG患者作为观察组,另选取30例非肿瘤脑疾病患者作为参照组,收集观察组患者的BG组织和参照组患者的非肿瘤脑组织。比较两组患者PLK1、POLR2A表达情况和不同临床特征BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A的阳性表达情况;比较不同PLK1、POLR2A表达情况BG患者的生存情况;采用Cox回归模型分析BG患者预后的影响因素。结果 观察组患者PLK1、POLR2A阳性表达率分别高于参照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。低分化BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A阳性表达率均高于中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。PLK1、POLR2A阳性表达患者的中位生存时间均明显短于PLK1、POLR2A阴性表达患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Cox多因素回归分析结果显示,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素(P﹤0.05)。结论 BG患者PLK1、POLR2A呈高表达,PLK1、POLR2A高表达BG患者中位生存时间缩短,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素。

新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂研究进展

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染席卷全球,寻找广谱抗病毒特效药一直是一项重大任务。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶是一类不同病毒间在结构和功能上高度保守的关键非结构蛋白,针对该聚合酶为靶点开发新的小分子抑制剂至关重要。本文作者从新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结构为出发点,详细阐述了该病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用机制以及不同种类抑制剂的特点。着重从药物化学的角度介绍了核苷类似物和非核苷类似物的作用特点和作用机制,综述了多种小分子聚合酶抑制剂化学结构与生物活性之间的关系。

新型抗病毒RNA聚合酶PA亚基抑制剂临床研究进展

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的对人类健康危害较重的呼吸道传染病。目前抗流感药物的应用主要面临病毒耐药性和对高致病性流感病毒的效价低的问题,如M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂存在药效低、时间窗口窄和耐药性等缺点。近来的抗流感药物研发的靶点聚焦于病毒RNA聚合酶。流感病毒RNA聚合酶是病毒在宿主细胞内完成复制和转录过程的关键酶,其中PA亚基通过内切酶活性为流感病毒的转录过程提供引物,成为潜在抗流感药物靶点。本文总结了以PA亚基内切酶为靶点的抗流感药物研究进展,旨在为开发安全有效的新型抗病毒RNA聚合酶抑制剂提供参考。

RNA依赖性RNA聚合酶作为抗戊型肝炎病毒药物作用靶点的研究进展

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是造成急性肝炎最常见的原因之一。HEV基因组由5′非编码区、3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)和3′非编码区组成,仅在HEV-1中发现了ORF4,并与ORF1重叠。各种编码蛋白在HEV的复制和感染中发挥着不同的作用,而HEV的复制是由ORF1编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)所介导的。HEV RdRp是由多个蛋白亚基组成的复合酶,具有7个保守基序,这些保守基序在RNA合成过程中发挥核苷酸识别、合成、延伸、修饰和稳定等作用,保证了RdRp的功能,在HEV的复制和转录中起到关键作用。因此,以RdRp作为抗HEV药物作用靶点的治疗方案具有很好的应用前景,是目前药物开发的一种主流思路。目前,已发现利巴韦林、索非布韦、2′-C-甲基胞苷(2CMC)等核苷类RdRp抑制剂和锌、GPC-N114等非核苷类RdRp抑制剂对HEV有较强的抑制作用,可作为潜在的抗HEV药物进行深入研究。笔者对HEV编码蛋白和HEV RdRp的结构与功能进行阐述,总结目前发现的对HEV有抑制作用的RdRp抑制剂,以期为HEV的药物开发提供一种新的思路。

英国研究构建叶绿体RNA聚合酶原子模型

叶绿体中的RNA聚合酶比较独特,它拥有比蓝藻还多的亚基,转录机制也更复杂。为进一步探究叶绿体RNA聚合酶的结构,英国约翰英纳斯中心科研人员使用冷冻电镜,对从白芥菜提取出来的叶绿体RNA聚合酶样本进行成像,并研究分析了其中的21个亚基等结构的作用,建立了原子水平的数据模型。该模型揭示了超氧化物歧化酶、赖氨酸甲基转移酶和氨基酸连接酶(亚基)的详细信息,为进行下一步分析各个蛋白的功能,理解叶绿体转录及其在植物生长过程中的作用机制提供了基础。相关研究成果发表在《细胞》(Cell)杂志上。

基于分子对接筛选宣肺败毒方和血必净注射液中抑制新型冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的活性物质

目的:筛选宣肺败毒方和血必净注射液中抑制新型冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RdRp)的活性物质。方法:以新型冠状病毒RdRp作为分子对接的靶蛋白,使用AutoDockTools软件对其去水加氢。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索出宣肺败毒方和血必净注射液中的有效活性小分子化合物,将其导入Chem 3D中进行能量最小化,用AutoDockTools加氢、调节化学键,然后与处理后的RdRp在AutoDock Vina中进行分子对接。最后通过Pymol、Discovery Studio、Ligplot进行可视化处理。结果:从TCMSP中分别检索出宣肺败毒方活性成分230个、血必净注射液活性成分125个。通过分子对接技术筛选出19个与RdRp结合能低于-8.0 kcal/mol的化合物。经可视化处理发现,宣肺败毒方中的大黄素甲醚二葡萄糖苷和埃沃生物苷、血必净注射液中的丹参酚酸j可很好地作用于RdRp的活性口袋,且与RdRp形成传统氢键、碳氢键及疏水键等相互作用。结论:本研究从宣肺败毒方和血必净注射液中筛选出与核苷酸竞争性结合新型冠状病毒RdRp的小分子,为研发抗新型冠状病毒感染的特效药提供理论依据。

真核生物RNA聚合酶的结构和功能概述

真核生物中存在三种RNA聚合酶,它们对基因的表达起着十分重要的作用。本文概述三种RNA聚合酶的结构和功能。

鹿茸多胺对小鼠肝细胞RNA聚合酶活性的影响

多次给小鼠po鹿茸多胺(PASPA)30mg/kg,可明显促进[~3H]leucine和[~3H]uridine掺入肝组织蛋白质和RNA。体外实验证明,鹿茸多胺在较低浓度(1～10μg/ml)时,对RNA聚合酶活性呈明显的增强作用。提示,鹿茸多胺刺激小鼠肝组织蛋白和RNA合成效应是由于其能够明显增强RNA聚合酶活性,尤其是显著增强RNA聚合酶Ⅱ的活性。

金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA聚合酶转录活性的影响

目的研究金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对呼吸道合胞病毒(RSV)RNA聚合酶转录活性的作用。方法通过体外分离病毒核糖核蛋白复合体(RNP)进行体外转录,并在转录过程中应用放射性核苷酸标记,同位素检测RSV的mRNA全长转录本,从而观察金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响。结果正常细胞组与病毒感染细胞模型组放射性核苷酸辐射强度有显著差异(P<0.01),而白藜芦醇组转录掺入的放射性核苷酸明显低于病毒对照组(P<0.01),而各含药血清组差异不显著。结论金欣口服液有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶有较好的抑制作用,其可能是金欣口服液抗RSV的作用机制之一。

稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.

互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶

构建含有感染性克隆HCV非结构基因 5b区序列的酵母表达质粒 ,转化毕加酵母 ,获得持续、可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)的表达 ,纯化蛋白在SDS -PAGE及Westernblot中显示出特异性的 6 4 2kDHCVRdRp蛋白带 ,同聚引物 /模板测定显示RdRp的活性极低 ,延长反应时间 ,RNA聚合活性仅轻度升高。采用合成的杂聚互补引物 /模板 ,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板 ,随时间延长 ,杂聚互补引物 /模板降解。

流感病毒RNA聚合酶的分离与纯化(英文)

目的 建立分离、纯化流感病毒RNA聚合酶PB1、PB2和PA 3P蛋白的有效方法 ,为进一步研究 3P蛋白的结构和功能奠定基础。方法 用甘油、CsCl1及CsTFA不同介质的密度梯度超速离心法进行分离 ,用SDS -PAGE电泳及Westernblot法检测 3P蛋白 ,用尿素变性PAGE检测vRNA。结果 用甘油密度梯度离心 ,可从病毒粒子中分离由NP、3P和RNA组成的RNP。将纯化的RNP用CsCl和甘油双组分不连续密度梯度离心 ,可形成NP和 3P -RNA两部分 ,使NP与 3P -RNA分离。进一步将 3P -RNA在CsTFA -甘油双组分不连续密度梯度介质中进行超速离心 ,可有效地将 3P与RNA分离 ,获得较纯的 3P蛋白。 3P位于离心管的上半部分 ,而RNA则位于离心管的近底端部分。结论 用甘油、CsCl-甘油和CsTFA

以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统研究进展

文章界定了与病毒拯救相关的一些概念,对T7RNA聚合酶(RNAP)为基础的病毒拯救系统研究进行概述。介绍了体外拯救方法及其缺点,并以最常用的痘病毒载体表达T7RNAP为基础的体内拯救方法为例,介绍了该方法对病毒拯救的研究进展及缺点,进一步介绍了无痘病毒表达T7RNAP细胞系的RNA病毒拯救体系的建立和研究,为病毒拯救,特别是以T7RNAP为基础的病毒拯救试验方案提供参考。

流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达

目的 将流感病毒RNA聚合酶PB1 1亚基进行亚克隆、表达 ,获得重组的亚克隆多肽 ,为进一步研究PB1亚基功能奠定基础。方法 以PB1亚基cDNA为模板 ,用PCR方法扩增出PB1 1片段 ,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组 ,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定 ,IPTG诱导各亚克隆系高效表达 ;优化表达条件。结果 PCR法扩增出 4 87bp的片段 ,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒 ,在E .coliM1 5中表达得到相对分子量约为 2 0KD的重组蛋白 ,获得重组多肽。结论 成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1

细菌RNA聚合酶亚单位研究进展

细菌的转录过程是一个由多种分子共同调控的复杂过程,其中RNA聚合酶(RNA polymer-ase,RNAP)是催化转录合成RNA的重要酶。作为RNAP中一个独立的亚单位,σ因子(sigma factor)在转录起始过程中起着至关重要的作用。最近的研究表明σ因子参与了转录起始的各个过程,包括启动子的定位、启动子的解链、起始RNA合成、脱离启动子等过程。由于其在细菌转录过程中的重要作用,σ因子正在成为抗菌药物研究的新靶点。本文对σ因子的结构、分类、功能以及以它为中心的调控网络的研究进行综述。

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率。PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7。用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达。将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达。反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达。用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率。

T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测人CEA

目的:建立检测人癌胚抗原(CEA)的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique,FACTT).方法:以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时进行夹心酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测人CEA.结果:成功的建立了检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术,其检测CEA的灵敏度达2×10^(-3)mg/L,比夹心ELISA方法灵敏度(0.25 mg/L)高125倍.结论:T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较夹心ELISA方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的早期诊断.

金欣口服液有效单体对呼吸道合胞病毒RNA聚合酶转录活性的影响

目的:探讨金欣口服液有效单体对呼吸道合胞病毒(RSV)RNA聚合酶转录活性的影响。方法:通过RSV感染体外培养的细胞并用药物干预、提取病毒核糖核蛋白复合体(RNP),体外转录,同位素检测RSV的mRNA全长转录本,检测金欣口服液及其主要有效成分对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性的影响。结果:与正常细胞组比较,病毒感染细胞模型组(病毒组)放射性核苷酸辐射强度明显增加;与病毒组比较,单体联合(黄芩苷+白藜芦醇)组辐射强度显著降低;而各血清组差异不显著。结论:金欣口服液有效单体黄芩苷+白藜芦醇联合作用能够降低RSV的RNA依赖的RNA聚合酶的活性,其可能是金欣口服液治疗呼吸道合胞病毒性肺炎的机制之一。