Ku70作为RNA解旋酶调节miR-124的加工成熟及神经细胞的分化

目的Ku70蛋白主要通过其DNA结合特性参与双链DNA断裂(DSB)的非同源端连接(NHEJ)修复,有报道称其具有RNA结合功能,本文探索Ku70是否具有RNA解旋酶活性并影响miRNA加工成熟。方法利用RNA免疫共沉淀(RIP)测序结合生物信息学分析Ku蛋白结合的RNA;蛋白质印迹法(Western blot,WB)结合定量反转录PCR(qRTPCR)检测Ku蛋白与miRNAs的表达关系;生物膜干涉技术(BLI)实验分析Ku蛋白与RNA的结合能力;电泳迁移率变动分析(EMSA)实验确定Ku70及Ku80的RNA解旋酶活性;形态学检测结合WB分析Ku70调节miR-124引起的神经细胞功能变化;免疫荧光结合形态学分析寨卡病毒(ZIKV)感染后Ku70及miR-124的变化与神经元分化关联。结果研究发现,Ku70蛋白具有RNA解旋酶活性,并通过其RNA解旋酶活性影响miRNA加工成熟。Ku70缺失引起许多miRNAs上调,其中包括神经细胞特异的miR-124。在人神经前体细胞(h NPCs)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中敲低Ku70可促进miR-124的成熟,从而导致上述细胞向神经元分化。本文进一步发现,ZIKV感染影响了Ku70及miR-124的表达,导致细胞形态的分化。结论本研究揭示了Ku70的一种新功能,即Ku70有可能参与miRNA的成熟调控和神经细胞的分化,并且可能是ZIKV病毒致小头症的原因之一。

RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤的相关性研究

RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的家族,是基因表达的重要调控因子,在RNA代谢的多个方面发挥作用。RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族既在RNA代谢中具有重要作用,又与人类细胞中基因组的不稳定性直接相关。而基因组的不稳定性是癌症克隆进化的驱动因素,能够促进癌症的发生发展。该文对RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤发生发展的相关性做一综述。

番茄DEAD-box RNA解旋酶基因SlDEAH1的克隆及表达分析

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄(Solanum lycopersicum)AC++中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明:SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA3、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。

RNA解旋酶Ddx5(p68)和Ddx17(p72)的特点和功能

DEAD box蛋白家族是一类在进化中高度保守的ATP依赖的RNA解旋酶,广泛存在于从细菌到哺乳动物的许多物种中,根据其氨基酸序列(Asp-Glu-Ala-Asp)命名的DEAD box RNA解旋酶不仅参与需要RNA结构调节的所有细胞过程,而且DEAD box家族的一些蛋白成员在转录调节中也发挥重要作用,如DEAD蛋白家族中高度相关的成员Ddx5(p68)和Ddx17(p72)对雌激素受体α、抑癌基因p53、肌原性调节蛋白MyoD和Runx2等的共激活作用。本文着重阐述DEAD box RNA解旋酶家族中Ddx5(p68)和Ddx17(p72)特点和它们在转录中的调节功能。

低温胁迫对番茄RNA解旋酶SlDEAD34基因表达的影响

利用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术对番茄RNA解旋酶SlDEAD34的蛋白结构特征、SlDEAD34基因的组织表达模式和低温胁迫条件下的基因表达情况进行了研究。结果表明,SlDEAD34包含9个保守基序,是DEAD-box型RNA解旋酶,与拟南芥LOS4高度同源,三维结构非常类似;SlDEAD34基因在生长6周的番茄根、茎和叶中均有表达,且根>茎>叶,在生长5个月的番茄9种组织器官中均有表达,其中在果实中表达量最高,在根中表达量最低;4℃处理时,番茄根中SlDEAD34基因下调明显,叶中表达量变化不明显,12℃处理时,番茄根和叶中SlDEAD34基因表达量变化均不明显。DEAD-box型RNA解旋酶SlDEAD34经低温4℃处理后基因表达量明显下调,暗示SlDEAD34基因响应低温胁迫,推测SlDEAD34基因可能参与调控低温逆境胁迫过程。

黄瓜RNA解旋酶基因家族的生物信息学鉴定和表达分析

利用生物信息学方法对黄瓜RNA解旋酶基因家族成员、基因分类、染色体定位和系统进化关系进行了分析预测,并利用实时荧光定量PCR技术检测了11个黄瓜DEAD-box RNA解旋酶基因的组织表达模式和NaCl、低温4℃、脱落酸(ABA)以及高温39℃胁迫条件下的表达变化。结果表明,黄瓜RNA解旋酶家族包含101个基因,DEAD-box、DEAH-box和DExD/H-box 3个亚家族分别包含32、27和42个基因成员;黄瓜的7条染色体均有RNA解旋酶基因分布,其中第3条染色体最多,有30个RNA解旋酶基因,仅有8个基因分布在第4条染色体上;黄瓜RNA解旋酶基因编码的蛋白包含376~2 330个氨基酸,等电点在5.13~10.00;qRT-PCR分析发现,除CsDEAD16和CsDEAD25外,其他基因在花中表达量均最高,在黄瓜根中仅检测到CsDEAD17、CsDEAD21、CsDEAD22和CsDEAD24的表达;黄瓜幼苗经上述胁迫处理后11个基因均有不同程度的表达量变化,其中CsDEAD16、CsDEAD21、CsDEAD22、CsDEAD24、CsDEAD25和CsDEAD27明显受ABA上调,而CsDEAD24的表达受高温诱导。本研究为进一步探索黄瓜RNA解旋酶基因在其生长发育中的作用和抗性作用机制,奠定了一定的理论基础。

猪瘟病毒NS3蛋白ATPase/RNA解旋酶功能区的表达与纯化

采用RT-PCR技术扩增出猪瘟病毒石门株和C株NS3基因的ATPase/RNA解旋酶功能区,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-NS3SM和pET-NS3C;PCR、酶切鉴定和序列分析结果表明目的基因插入位置、方向和读码框完全正确;0.8 mmol/L IPTG诱导得到分子量为54kD的目的蛋白,Western blotting结果表明,表达的目的蛋白与猪瘟高免血清没有出现肉眼可见的反应;通过ELISA试验结果表明,重组蛋白能被CSFV阳性血清识别。

两个苹果RNA解旋酶基因的基本特征与表达分析

利用生物信息学方法对2个苹果RNA解旋酶基因染色体定位、系统进化关系和氨基酸序列基本特征等进行了预测,分析了基因在果实成熟期和砧穗互作中的表达差异;利用PlantCARE软件对二者的启动子序列中所包含的响应元件进行了预测和分析;利用qRT-PCR方法分析了2个苹果RNA解旋酶基因的组织表达模式。结果表明:"金冠"苹果基因组中鉴定了2个RNA解旋酶基因,命名为Mdhelicase1、Mdhelicase2,分别分布在苹果第6、17条染色体上;表达谱芯片分析发现,在苹果果实成熟时期和砧木接穗互作过程中,Mdhelicase1和Mdhelicase2基因的表达有不同程度的变化;2个基因的启动子区域存在多个胁迫响应元件,如MBS、HSEs、TCrich repent、AREs、ABREs、GARE motif、P box、CGTCA motif、TGACE motif、Light responsive elemonts等。Mdhelicase1、Mdhelicase2在"平邑甜茶"茎、叶、花、果实中都有表达,二者分别在茎和叶中的表达量最高。

RNA解旋酶和应激颗粒

应激颗粒(stress granules,SGs)是细胞在环境压力刺激下停止蛋白质翻译后,mRNA与多种细胞蛋白组装而成的胞质颗粒结构.RNA解旋酶家族作为生物体内普遍存在的一类高度保守的蛋白质酶类,参与了RNA代谢各个环节,近年来其家族成员被陆续发现是一类新的SG重要组分.本文综述了RNA解旋酶参与应激颗粒形成过程,RNA解旋酶家族蛋白的结构和其参与应激颗粒形成的研究进展.

利用转基因技术初步鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能

本研究利用前期抑制差减杂交技术筛选获得的香蕉果实上调表达的基因片段,经NCBI比对,表明该基因片段属于香蕉ATP依赖的RNA解旋酶(Helicase)基因家族成员,含有完整的RNA解旋酶超家族C-末端结构域HELICc结构。经Southern杂交证实,此RNA解旋酶基因在香蕉基因组中只有一个拷贝。构建RNA解旋酶基因的反义基因植物表达载体PBIPC86,转化番茄获得6株转基因番茄植株。转基因番茄植株的叶、花和生长形态均有变异,部分转基因番茄生长势弱。该研究结果对鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能奠定了初步基础。

RNA解旋酶参与植物叶片衰老调控研究进展

对植物叶片衰老机制进行了概括,并对RNA解旋酶参与叶片衰老及相关性状调控研究进展进行阐述,总结了RNA解旋酶的细胞学功能和玉米叶片衰老的研究进展,进而对RNA解旋酶基因在玉米熟期遗传改良中的应用进行了探讨。

老年胃癌患者DEAD-box蛋白家族RNA解旋酶3的表达及临床意义

目的研究老年胃癌患者DEAD-box蛋白家族RNA解旋酶3(DDX3)的表达情况,分析其表达与临床病理参数的相关性。方法选择70例经病理证实的老年胃癌患者,采集胃癌组织和癌旁组织标本,分别采用免疫组化法和RT-PCR法检测DDX3蛋白及mRNA,分析DDX3的表达与病理参数的相关性。结果 DDX3蛋白在胃癌组织中的阳性表达率(51.4%)高于癌旁组织(8.6%),差异有显著性(χ~2=30.6122,P=0.000)。DDX3 mRNA表达吸光度值(1.48±0.19)高于癌旁组织(1.05±0.23),差异有显著性(t=11.8809,P=0.000)。胃癌分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度及是否存在淋巴结转移与DDX3表达阳性率有关,胃癌低分化、临床分期Ⅲ～Ⅳ期及出现淋巴结转移者DDX3表达阳性率较高。DDX3 mRNA的表达与胃癌分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度及是否存在淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论 DDX3的高表达与老年胃癌的发生、发展相关。

RNA解旋酶DDX3与转移性乳腺癌预后关系的研究

目的探讨RNA解旋酶DDX3与转移性乳腺癌预后的关系。方法收集2010年1月至2012年12月间就诊金华市中心医院确诊为转移性乳腺癌(Ⅳ期)的患者共83例,经RT-PCR技术检测术后癌组织及癌旁组织RNA解旋酶DDX3的表达情况,分析其与转移性乳腺癌患者术后生存状况的关系。结果通过RT-PCR检测结果显示,RNA解旋酶DDX3在转移性乳腺癌组织中的表达(0.49±0.06)显著高于癌旁组织的表达量(0.23±0.02)(t=4.956,P<0.05)。同时,RNA解旋酶DDX3在转移部位、转移部位数、雌激素受体/孕激素受体(ER/PR)状态临床因素中表达存在明显差异(t/F值分别为8.013、9.227、8.246,均P<0.05),而在年龄、是否绝经、癌组织类型临床因素中不存在明显差异(t/F值分别为1.432、0.914、1.107,均P>0.05)。DDX3的表达水平≥0.45在术后3年的复发率明显高于其表达水平<0.45者(χ2=8.121,P<0.05)。同时,DDX3的表达水平≥0.45者的平均复发时间也短于其表达水平<0.45者,两组差异均具有统计学意义(t=7.235,P<0.05)。利用Cox风险回归模型分析结果显示,转移部位、转移部位数、DDX3的表达量是转移性乳腺癌术后预后的独立危险因素(OR值分别为1.427、1.203、2.886,均P<0.05),术后辅助放化疗是保护因素(OR=0.779,P<0.05)。结论 RNA解旋酶DDX3是转移性乳腺癌患者术后预后的影响因素,通过对RNA解旋酶DDX3的检测可为转移性乳腺癌患者临床诊治提供一定的参考价值。

玉米DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆及分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解等重要的生命活动.根据本室在S-Mo17Rf3Rf3cDNA芯片研究中,检测到花粉发育后期RNA解旋酶上调表达的结果,应用RACE技术从S-Mo17Rf3Rf3花粉中克隆得到该RNA解旋酶基因全长cDNA,命名为ZmRH2并在GenBank注册登记(DQ327709).序列分析表明该cDNA全长1652bp,从第163bp开始到1386bp含有一个开放阅读框,编码407个氨基酸.其编码的蛋白质具有DEAD-boxRNA解旋酶特有的9个保守模体,与水稻、拟南芥和豌豆中的DEAD-boxRNA解旋酶的氨基酸序列存在着很高的同源性.RT-PCR分析表明,该基因在近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3的叶、根、和雌穗中的表达没有差异,但在花丝和花粉中有明显差异.

猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase/RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-sGXNS3和pET-sCNS3。PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确。1 0mmol/LIPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白,Westernblot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别。

南极冰藻Chlam ydomonas sp.ICE-L RNA解旋酶CiDDX5的基因特征及其表达分析

DEAD-box RNA解旋酶能介导NTP依赖的双链RNA解旋,大量的研究表明其在植物的各种非生物胁迫的适应过程中发挥着重要作用。本研究从严格嗜冷的南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的EST序列中筛选并克隆得到了DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5的全长基因,利用生物信息学软件对该基因编码的蛋白序列进行了研究,并通过实时定量PCR研究了在低温、高盐胁迫下CiDDX5基因表达量的变化。研究结果显示,DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因的编码区长2 077bp,编码513个氨基酸。在以氨基酸序列构建的系统进化树中,CiDDX5序列和其他绿藻类的聚在一起,与莱茵衣藻,团藻和胶球藻的蛋白序列同源性依次分别为65%,64%和63%。实时定量PCR研究结果表明,在低温和高盐胁迫下,CiDDX5基因的表达量都有一定程度的提高,提示该基因的功能与南极衣藻适应低温、高盐的海冰环境的特性相关。

RNA解旋酶DDX39对肾透明细胞癌增殖的影响

目的通过小干扰RNA沉默检测DDX39基因对肾透明细胞癌增殖的影响及其相关机制。方法应用脂质体转染法将DDX39-siRNA转染人肾透明细胞癌786-O细胞,试验设空白对照组、阴性对照组、小干扰RNA转染组(DDX39-siRNA)。应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测DDX39-siRNA的干扰效率;MTT法和平板克隆形成实验检测DDX39对786-O细胞增殖的影响;Western印迹法检测细胞增殖指标PCNA;流式细胞术检测DDX39-siRNA干扰后786-O细胞周期的变化。结果与阴性对照组相比,转染DDX39-siRNA后,786-O细胞中DDX39 mRNA及其蛋白的表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);DDX39-siRNA干扰后786-O细胞增殖能力受到抑制,克隆形成能力明显下降;S期细胞减少,G2/M期细胞百分比明显增加(P<0.05)。结论 DDX39敲减后可显著抑制肾癌细胞786-O细胞增殖,并阻滞细胞于G2/M期。

几种不同细胞系之间P68 RNA解旋酶表型差异的研究

对分别来自4种不同细胞系的细胞,在生长期间胞内P68 RNA解旋酶的动态变化进行了蛋白质和mRNA的比较研究。结果发现随着细胞培养时间的延长,各系细胞中P68 RNA解旋酶均呈现出有规律的改变,并且这种规律具有明显的细胞系特征:肿瘤细胞系之间表现出P68 RNA解旋酶蛋白条带单一的一致性;非肿瘤细胞系P68 RNA解旋酶蛋白出现多条带变化,并表现出明显的适应性;肿瘤细胞系与非肿瘤细胞系之间P68 RNA解旋酶的表型存在着明显的差异,这种差异从分子水平上揭示出P68 RNA解旋酶与细胞生长密切相关,并可能与细胞癌化有关。对产生这种差异的可能原因及其生物学意义进行了讨论。

原发性肝癌组织中RNA解旋酶DDX21表达与预后的相关性分析

目的:探讨RNA解旋酶DDX21在原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达情况,分析其与肝癌患者的临床预后关系和意义。方法:我们通过免疫组织化学方法检测86例行根治性切除术的肝细胞肝癌患者癌和癌旁组织中的RNA解旋酶DDX21表达水平。统计分析RNA解旋酶DDX21的表达与临床病理参数的关系,运用癌症相关生存分析工具Kaplan-Meier,分析观察RNA解旋酶DDX21的表达水平与患者预后生存期的关系,建立Cox回归模型,寻找影响肝细胞肝癌患者预后的独立因素。结果:癌旁组织胞浆中RNA解旋酶DDX21表达高于癌组织中的表达(P<0.05);癌旁组织胞浆中RNA解旋酶DDX21高表达患者预后良好和无病生存率显著高于RNA解旋酶DDX21低表达患者,肿瘤大小和RNA解旋酶DDX21蛋白表达水平均与肝细胞肝癌预后密切相关(P<0.05);Cox回归分析显示,肿瘤大小和RNA解旋酶DDX21蛋白表达水平均与肝细胞肝癌预后良好显著相关(P<0.05)。结论:RNA解旋酶DDX21有望成为影响肝细胞肝癌患者预后的生物标志物。