采用Cell-SELEX技术的核酸适配体在肿瘤靶向治疗的研究进展

阐述细胞-配体指数富集系统进化(Cell-SELEX)技术特点,以及通过该技术筛选得到的核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的应用进展和挑战,通过查阅近年的相关文献,综述核酸适配体作为药物及药物载体在肿瘤靶向治疗中的应用研究进展。结果表明:基于Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的疗效显著,可开发成为肿瘤靶向治疗的潜力药物及良好的药物载体。

随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

指数富集配基的系统进化 (SELEX)技术是一种新的组合化学技术 .体外构建了一个长度为 81nt、含有35个随机序列的单链DNA (ssDNA)文库 ,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件 .通过对比不对称PCR和生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果 ,确定了以生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA .由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高 ,因此选择以微孔板为介质 ,分离与靶蛋白结合的适配子 .经过 9轮循环筛选 ,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (C蛋白 )的结合率从 0 . 5 %上升到 32 . 5 % .

哈维氏弧菌适配子的SELEX筛选及其亲和特异性研究

哈维氏弧菌是水产养殖中的重要条件致病菌,对其进行快速、准确地检测和鉴定是相关病害防治的基础和关键.适配子具有亲和力高、特异性强、稳定性好等优点,在微生物的检测和鉴定方面呈现出广泛的应用前景.本研究以哈维氏弧菌为靶目标,采用SELEX技术,即指数级富集配体的系统进化技术,筛选其特异性适配子.经15轮筛选后,随机ssDNA文库的亲和力从3.51上升到58.95,提高了15.8倍.筛选出的适配子富集库经克隆、测序后得到52条不同序列,根据同源性将这些序列分成8个家族,其中第1和第2家族的适配子数量最多,超过总数的50%.通过深入分析,筛选出6个对哈维氏弧菌有显著亲和特异性(P<0.01)的高频适配子,其中5个高频适配子(S1、S25、S26、S27、S35)对哈维氏弧菌有较高的亲和力,相应的亲和常数Kd值分别为(32.6±7.1)、(45.3±10.1)、(24.7±5.8)、(34.8±5.6)、(12.9±4.0)nmol/L.本文还对高频适配子的产生机制及其应用价值进行了探讨.本文首次筛选出了对哈维氏弧菌具有较高亲和特异性的适配子,为后续利用适配子进行哈维氏弧菌的检测和鉴定奠定了基础.

SELEX技术筛选毒死蜱单链DNA适体

试验旨在利用SELEX技术体外筛选毒死蜱的特异性适体。体外合成全长为91 nt的ssDNA文库,以链亲和素修饰的凝胶为载体、毒死蜱为靶分子进行SELEX(配体指数增强系统进化技术)筛选。利用荧光标记法测定适体的筛选效率、亲和力和特异性,通过MFOLD分析软件对亲和力较高的适体进行二级结构预测和结合位点分析。结果表明,经过15轮筛选后,DNA文库的筛选效率达到44.00%;最终获得9条ssDNA适体,其中适体N23对毒死蜱具有最高的亲和力,其结合活性显著高于N23与水胺硫磷、丙溴磷、氧化乐果的结合活性;二级结构表明茎环结构可能是毒死蜱与适体相互作用的结构基础。

SELEX筛选嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)适体方法的建立

嗜水气单胞菌是水产养殖中一种比较常见的致病病原菌。本研究以嗜水气单胞菌为研究对象,利用SELEX指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX),经过12轮的筛选,通过生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力,克隆、测序后,用DNAMAN软件分析其一级序列与二级结构。研究结果表明,通过12轮筛选后,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72,亲和力提高了2.25倍。一级结构主要由GT组成,说明同源性适体有了一定程度的富集。二级结构模拟图以茎环状结构为主,说明这些茎环状结构可能是适体与靶分子进行结合作用的基础,也是其进一步形成三维空间结构的基础。

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.

靶标替换消减SELEX技术筛选小鼠IgG Fc片段的DNA配基及其活性鉴定

建立高特异性和亲和力的小鼠IgGFc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的Fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配基进行活性鉴定.经过16轮筛选,得到了与小鼠IgG不同亚类相同Fc片段特异性结合的寡核苷酸配基(IgG的Fc配基).特异性分析显示,此配基只与小鼠IgG特异性结合,与胰蛋白酶、小牛血清白蛋白、人血清均无明显结合.高压液相色谱和凝胶阻滞结果均说明了配基和靶蛋白具有特异结合.通过使用靶标替换消减SELEX技术可以有效得到小鼠IgG不同亚型相同部分Fc片段的特异性结合配基,为不同分子相同部位的分子作用机制,以及应用于小鼠抗体亲和层析的研究奠定基础.

适体SELEX筛选中单链DNA的制备

探讨建立适体SELEX筛选中单链DNA(ssDNA)的制备方法,生成适体筛选的次级库,为适体SELEX筛选奠定基础。将PCR扩增后带生物素标记的双链DNA(dsDNA)连接在链霉亲和素标记的凝胶上,用NaOH变性解链制备ssDNA。利用荧光法分析dsDNA与凝胶结合所需的时间及NaOH对生物素与链霉亲和素标记凝胶结合的影响,在优化的试验条件下制备ssDNA,用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳对其产物进行鉴定。结果显示:生物素标记的dsDNA与链霉亲和素标记的凝胶结合的时间以40 min为佳,0.01 mol/L、0.10 mol/L和1.00 mol/L的NaOH均不影响生物素与链霉亲和素标记凝胶的结合;在优化试验条件下制备的产物为ssDNA。表明采用上述方法制备ssDNA,操作简单、方便,所需时间短,适用于适体SELEX筛选中次级库的生成。

SELEX技术及Aptamer研究的新进展

综述了近几年指数富集的配体系统进化(SELEX)技术的改良与寡核苷酸配基(aptamer)研究应用方面的新进展.Aptamer是指利用SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术,从随机寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链寡核苷酸配基,通常具有纳摩尔到皮摩尔的亲和力.高通量筛选的技术特点与aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性,使得aptamer在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景.

SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-7901细胞适配子。方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库,通过优化PCR扩增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃癌SGC-7901细胞的特异性适配子。将最后一轮筛选产物克隆、测序并用相关软件分析适配子序列的一级结构和二级结构。结果:经12轮SELEX筛选,ssDNA文库与SGC-7901细胞的亲和力由0.16上升至1.14,表明特异性适配子得到逐步富集。22个克隆子测序,有4个序列完全一致,二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞作用的结构基础。结论:成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法。

SELEX技术应用研究进展

SELEX技术是一项在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的新组合化学技术。其优点是筛选出的核酸适体易合成、易存储、易修饰等。该技术不仅在疾病(如艾滋病)的治疗及药物的开发等方面起着重要的作用,也为核酸和蛋白质结构及功能的研究提供了一种有效的方法。

SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子方法的建立

目的建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础。方法在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛选方法并进行4轮筛选。结果确定了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应的最佳条件,采用液相筛选方法经过4轮筛选,随机单链DNA(ssDNA)文库与内毒素(LPS)的结合率明显上升,CPM值与初始库相比差异有统计学意义。结论建立了SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子的筛选方法。

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体（英文）

目的通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术。方法以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体。结果通过6轮筛选,筛选得到的次级ss DNA库通过PCR扩增得到ds DNA,ds DNA与p MDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体。获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合。结论利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力。

SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用

目的筛选针对Orai1分子第1膜外区蛋白的核酸适配体,探讨适配体通过拮抗钙离子释放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)抑制肥大细胞活化的效应。方法构建随机单链DNA文库,利用不对称PCR对单链DNA文库进行扩增。采用聚苯乙烯酶联板为介质的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术筛选核酸适配体。利用酶联免疫吸附实验检测各轮筛选序列与靶蛋白的亲和力,验证适配体与靶蛋白的特异性结合;激光共聚焦显微镜观察适配体对细胞内钙离子浓度变化的影响;利用IgE介导的肥大细胞脱颗粒模型,观察适配体对β-氨基己糖苷酶释放的抑制效应。结果经过12轮SELEX筛选,获得了7条核酸适配体,其中AptamerY1解离常数(Kd值)为1.72×10-8mol/L。以终浓度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介导的人肥大细胞系LAD2钙离子内流,并对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95%。结论通过SELEX筛选,获得了7条针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体,所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制,进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放。

利用SELEX技术构建靶向光敏药物

肿瘤是目前威胁人类健康最凶险的疾病之一。寻找选择性好、副作用小的防治恶性肿瘤的新方法仍然是当今医学研究的热点。光动力学疗法是近年来兴起的极具应用前景的肿瘤治疗新方法。开发新型靶向光敏剂和开展靶向光动力治疗是进一步发展光动力治疗肿瘤的重要方向。本文简述了目前光动力治疗及常用光敏剂的研究现状,并提出通过指数式富集法配体进化技术即SELEX技术构建靶向光敏药物的新设想。

SELEX技术与适体

SELEX技术是从随机寡核苷酸文库中筛选与靶分子特异结合序列的组合化学技术。随机寡核苷酸的多种空间结构是筛选基础。该技术对靶分子无特殊要求,筛选出的寡核苷酸被称为适体。适体最突出的特征是与靶分子的特异性高亲和力。

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.

SELEX技术及其在植物检疫中的应用前景

SELEX是从人工体外合成的随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的适配体的筛选技术。该技术的基本途径主要是通过人工合成的随机寡核苷酸序列文库,历经筛选、分离、富集得到能与各种配体结合的寡核苷酸适配体,具有高特异性、高亲和力和稳定性良好的特点。本文综述了SELEX技术的发展,介绍了目前的研究进展,以及该技术在植物检疫领域中的应用情况,并对其前景进行分析和展望。