羊驼TGF-β1基因的克隆及表达分析

旨在克隆羊驼TGF-β1基因,了解TGF-β1序列特征及其在不同组织中的表达特征,寻找TGF-β1基因的mRNA表达量与毛色之间的相关性,为研究TGF-β1基因的生物学功能提供基础。以羊驼为材料,利用3′和5′RACE技术克隆羊驼TGF-β1基因,利用DNAman、PROSITE和megAlign软件分别分析序列特征和相似性,应用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析TGF-β1基因在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的表达及TGF-β1在山羊不同组织中的表达特异性。结果表明,羊驼TGF-β1cDNA克隆全长为1 364bp(GenBank登录号:KF887499),ORF长1 173bp,编码390个氨基酸。氨基酸序列分析显示,羊驼TGF-β1具有其家族的典型结构特征,与其他哺乳动物相似性很高,与野猪的亲缘关系最近。羊驼TGF-β1基因在棕色羊驼皮肤组织中的表达量是白色羊驼皮肤组织的3.5倍。组织特异性分析表明,TGF-β1在山羊不同组织中均有表达,且在淋巴组织中表达量相对最高。羊驼TGF-β1全长cDNA的克隆和不同组织器官TGF-β1基因表达分析显示,TGF-β1与羊驼毛色形成密切相关。本研究为深入探讨TGF-β1参与动物毛色形成及调控的分子机制奠定了基础。

外源TGF-β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Dol,在其BamHⅠ酶切位点插入猪TGF-β1的1.7kbcDNA,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒DNA转染到小鼠ES-5细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的ES-5细胞克隆(ES-T),经RNA点杂交,Northern印迹杂交证明有6个细胞克隆能表达外源猪TGF-β1的mRNA,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Southern印迹杂交,也证明猪TGF-β1基因已整合到ES-5细胞基因组。经SELISA和生物活性测定,证明ES-T细胞存在着过度表达的TGF-β1基因产物。ES-T细胞生长特性与其亲代ES-5细胞相比,未发现明显差异。经低浓度RA处理悬滴培养的ES-T6细胞,将形成的拟胚体移至用白明胶铺底的培养板中,则最终有95%左右的拟胚体分化出血管样结构,而ES-5细胞在相同培养和处理条件下,只有17.8%形成无规则的管状结构,这结果提示ES-T6细胞基因组中外源TGF-β_1的额外表达,在调节该细胞株分化形成血管样结构中起着重要作用。同时,我们的实验体系也提供了一个适合于研究内皮细胞发生和血管形成的模型。

含RGD肽基因导入系统介导TGF-β1基因转染对兔骨髓基质干细胞增殖和体外诱导成骨的影响

目的探讨一种新型靶向性非病毒载体—含RGD肽K16GRGDSPC(记作K16-RGD)介导外源基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的可行性,观察转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对BMSCs的增殖和体外诱导成骨的影响。方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体将转化生长因子β1质粒pcDNA3-TGF-β1导入兔BMSCs,以导入空载体pcDNA3作为对照,G418筛选得到阳性细胞集落(分别命名为BMSCs-TGF-β1和BMSCs-pcDNA3),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)和流式细胞仪(FCM)检测细胞体外增殖活性,并进行成骨诱导扩增,检测转基因细胞经成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙蛋白(OCN)含量、核心结合因子a1(Cbfa1)的表达、矿化(钙结节形成)情况。以经诱导的BMSCs-pcDNA3和未转染BMSCs作为对照。结果RT-PCR显示转基因细胞能高表达TGF-β1,BMSCs-TGF-β1的体外增殖活性明显高于对照组(P<0.01);BMSCs-TGF-β1经成骨诱导后表达的成骨特征性表型(ALP、OCN、Cbfa1的表达和矿化)与对照组有显著的差异(P<0.01)。结论含RGD肽K16-RGD可以作为一种较理想的新型基因转移载体介导外源基因转染BMSCs;TGF-β1可以作为骨组织工程种子细胞BMSCs向成骨细胞定向分化的理想调控因子之一。

TGF-β1基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖

目的:探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEC-B3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法:将pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法)。结果:pEGFP-TGF-β1成功转染后,HLEC-B3逐渐变圆、脱壁。转染后24～48h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);凋亡细胞比例(转染24h为(21.0±1.7)%,转染48h至(43.6±1.4)%明显升高,与相应对照组[24h为(0.42±0.06)%,48h为(0.60±0.02%)]比较,差异均有统计学意义(P<0.01);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染24h为(72.0±1.9)%,转染48h为(74.7±2.2)%]增加和S期细胞比例[转染24h为(20.4±2.2)%,转染48h为(19.4±1.4)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:pEGFP-TGF-β1可成功转染HLEC-B3,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。

输注TGF-β1基因修饰的供体脾细胞诱导同种大鼠移植心脏耐受的实验研究

目的:研究TGF-β1修饰的供者脾细胞特异性输注对同种大鼠移植心脏耐受的诱导及效果。方法:建立同种大鼠异位心脏移植模型,用脂质体转染TGF-β1基因修饰供者脾细胞;观察TGF-β1修饰的脾细胞输注组,单纯脾细胞输注组和假处理组移植心脏存活天数和病理改变。结果:建立了稳定转染TGF-β1基因的脾细胞;TGF-β1修饰的脾细胞特异性输注可明显延长移植心脏存活时间(17.0±3.3)d,与单纯脾细胞输注组(7.0±1.1)d和假处理组(6.3±1.0)d比较,差异有显著性(P<0.05);而且可明显减轻同种移植心脏的病理损伤。结论:输注TGF-β1基因修饰的供体脾细胞可诱导同种大鼠移植心脏的耐受产生。

腺病毒介导的TGF-β1基因转导对小鼠自身免疫性心肌炎的治疗作用

目的 :研究腺病毒介导的 TGF- β1基因转导对小鼠自身免疫性心肌炎的治疗作用。 方法 :以猪心肌肌凝蛋白免疫BAL B/ c小鼠 ,诱导自身免疫性心肌炎 ;实验组以腺病毒为载体转移 TGF- β1基因 ,对照组则转移 L acz基因 ;采用 EL ISA法测定血浆 TGF- β1浓度 ,间接 EL ISA法检测肌凝蛋白自身抗体 ,荧光酶联免疫法检测肌钙蛋白 I;从心肌炎细胞浸润程度、血浆肌钙蛋白 I水平、血浆肌凝蛋白自身抗体滴度评估 TGF-β1转基因治疗自身免疫性心肌炎的作用。结果 :实验组血浆 TGF-β1浓度显著高于对照组和正常小鼠 (P<0 .0 1) ,对照组和正常小鼠无显著性差异 ;实验组小鼠心肌炎细胞浸润程度明显低于对照组 ,血浆中的肌钙蛋白 I水平和抗肌凝蛋白自身抗体水平低于对照组 (P<0 .0 1)。结论 :腺病毒介导的

藤梨根有效成份对结肠癌小鼠TGF-β1基因调控作用的影响

目的RT-PCR检测藤梨根对结肠癌小鼠模型癌基因TGF-β1的影响.方法：建立HT-29结肠癌小鼠模型,予藤梨根有效成分灌胃治疗4周后,采用荧光定量RT-PCR检测TGF-β1基因的表达水平.结果：干预组藤梨根有效成分处理4周后,TGF-β1 mRNA的表达显著低于未用藤梨根处理的模型组（t=2.541,P =0.016）.结论：藤梨根有效成分可以下调HT-29结肠癌小鼠TGF-β1基因的表达,其机制可能为抑制瘤体组织中TGF-β1基因的过表达,干预TGF-β1的突变或稳定TGF-β1基因的表达来调控癌变的进展.

TGF-β1基因多态性及其与两个山羊品种产羔数的相关分析

为研究波尔山羊和陕南白山羊转化生长因子β1(TGF-β1)基因遗传多态性及其与产羔数的相关性,根据绵羊TGF-β1基因序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术检测山羊TGF-β1基因外显子1和内含子2的多态性,同时用最小二乘法研究了其多态性与产羔数的关系。结果表明,在波尔山羊和陕南白山羊中,仅第2内含子(P2)存在多态位点,分别定义为MM、LM和LL基因型。MM型与LL型相比在内含子2的790bp处碱基发生G→C的突变。多态位点均以L为优势等位基因,基因频率分别为0.540和0.659,在波尔山羊的3~4胎和平均产羔数中,MM型个体的产羔数显著高于LM和LL型个体(P【0.05);LM型个体的第2胎产羔数显著高于LL型个体(P【0.05);在陕南白山羊的2~4胎和平均产羔数中,MM型个体显著高于LM和LL型个体(P【0.05),TGF-β1基因多态位点与产羔数显著相关,可以用于山羊分子遗传育种的候选基因。

梅花鹿TGF-β1基因的克隆及序列分析

从梅花鹿的鹿茸血中提取总DNA,经PCR扩增后,对梅花鹿的TGF-β1基因部分片段进行了克隆测序,序列长度为839 bp,现已将该序列提交到Gene Bank上。Gene Bank中的Blast分析表明,梅花鹿TGF-β1基因与牛同源性为92%,与羊同源性为94%。

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用,通过NCBI获得TGF-β1基因序列,TGF-β1 cDNA全长1571 bp,编码377个氨基酸。系统进化树分析发现,TGF-β蛋白按照不同的类型严格聚类,斑马鱼TGF-β1与其他鱼类的TGF-β1聚集到一个分支,在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示,TGF-β1基因为母源表达基因,在分节期之前的表达水平比较低,而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现,TGF-β1基因在斑马鱼24 hpf胚胎中开始有特异信号出现,TGF-β1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处,表明TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎,发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现,低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-β1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明,TGF-β1基因参与斑马鱼胚胎发育调控,并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-β1基因的功能奠定基础。

TGF-β1基因g.8666_8667delAC位点突变与大白猪繁殖性能的关系

[目的]本文旨在了解大白猪转化生长因子β1(TGF-β1)基因第4内含子序列特征,分析其突变位点多态性与繁殖性能的关系及潜在机制。[方法]利用PCR扩增和测序技术获得大白猪TGF-β1基因第4内含子序列,用生物信息学软件分析序列特征;利用DNA混池测序技术筛选目标序列突变位点,用直接测序法进行基因分型,用SAS软件对突变位点多态性与繁殖性能进行关联性分析;利用克隆测序技术测定不同基因型个体卵巢颗粒细胞中TGF-β1基因编码区序列,分析突变对mRNA剪接的影响。[结果]大白猪TGF-β1基因第4内含子序列全长189 bp,含有1个微卫星(GT)_(6)和多个顺式作用元件结合位点,与杜洛克猪相应序列的一致性为98.94%。在第4内含子63~64核苷酸处(TGF-β1基因的8666~8667核苷酸处)发现一个2 bp序列的插入/缺失突变,命名为g.8666_8667delAC。在大白猪群体中发现3种基因型(ins/ins、ins/del和del/del),其中ins/ins为优势基因型(57.8%)。关联性分析发现,ins/del基因型母猪的初产死胎数(NSB)显著高于另2种基因型(P<0.05);del/del基因型母猪的总产仔数(TNB)比ins/ins基因型和ins/del基因型分别高0.47和0.46头(P>0.05)。克隆并测序后发现ins/ins基因型和ins/del基因型母猪卵巢颗粒细胞中TGF-β1基因编码区序列长度一致。[结论]TGF-β1基因是大白猪繁殖性状的候选基因,g.8666_8667delAC位点del/del基因型是总产仔数(TNB)的有利基因型,ins/del基因型母猪初产死胎数(NSB)较高;g.8666_8667delAC位点突变不是通过影响TGF-β1基因的选择性剪接来影响繁殖性能。

猪TGF-β1基因多态性及组织表达谱分析

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是TGF-β超家族的重要成员,是一类多功能的细胞因子,在细胞生长、分化、迁移、免疫调节和细胞外间质(ECM)形成等过程中具有重要作用。因此,本研究通过采用PCR-SSCP方法,对猪TGF-β1基因内含子6的单核苷酸多态性进行检测和分析。结果表明:在晋汾白猪中检测到两种基因型(AA、AB),而在新山西黑猪中检测到三种基因型(AA、AB、BB),晋汾白猪和新山西黑猪在TGF-β1基因的多态位点的基因型分布差异极显著(P<0.01)。研究成功建立了TGF-β1基因变异信息及其组织表达情况,将为进一步分析猪TGF-β1基因变异与猪繁殖性能的相关分析提供基础资料。

TGF-β1基因修饰骨髓基质细胞复合Bio-Oss胶原修复犬颌骨缺损的效果

目的:观察TGF-β1基因修饰骨髓基质细胞(BMSC)复合Bio-Oss胶原修复Beagle犬颌骨缺损的效果。方法:Beagle犬18条,随机分为3组:种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料(对照组);种植体+0.5μg/L TGF-β1基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料(实验组A);种植体+10μg/L TGF-β1基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组(实验组B)。术后24周取材,组织观察缺损区恢复情况。RT-PCR检测细胞中OC、BSP及COL-ⅠmRNA的表达情况。Western Blot检测细胞中OC、BSP及COL-Ⅰ蛋白的表达情况。结果:HE染色结果显示实验组A骨连续性及成熟度优于实验组B。RT-PCR结果显示实验组A三种mRNA表达量明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组B中3种mRNA表达量与对照组相比,不具有统计学意义(P>0.05)。此外,Western Blot结果中实验组A的蛋白表达量与对照组和实验组B相比明显增加,具有统计学意义(P<0.05),实验组B较对照组略有增加,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:低浓度的TGF-β1基因可较好地促进BMSC向成骨分化。

妊娠期高血压疾病的临床特征与TGF-β1基因核苷酸多态性观察

目的观察妊娠期的高血压孕妇同正常孕妇间,于TGF-β1基因方面所存在的差异,以便进一步对TGF-β1基因其核苷酸的多态性予以探讨,以及对妊娠期的高血压疾病产生的影响。方法随机抽取200例正常孕妇(A组)与妊娠期患高血压疾病的200例孕妇(B组)资料,予以DNA样本进行提取,并对其TGF-β1基因进行分析。检查两组孕妇的临床数据。对比临床特征与TGF-β1基因其核苷酸的多态性分布,并分析其临床特征同TGF-β1基因核苷酸多态性之间的关系。结果对AB两组孕妇临床特征进行对比后发现,两组组孕妇的血糖与甘油三酯以及高密度的脂蛋白和低密度的脂蛋白等指标,差异无统计学意义(P>0.05);但B组孕妇体重指数与血压以及总胆固醇指标较A组差异有统计学意义(P<0.05)。AB两组孕妇TGF-β1基因核苷酸多态性分布比较,B组孕妇(1)-988C/A(2)-800G/A(3)-509C/T(4)+869T/C(5)+915G/C(6)+788C/T(7)+861C/T(8)+713-8delC这些SNP呈多态性分布,而出现频率比较显著的是位点为TC、TT、CC、GC。同时B组64例发病较早,且程度较重的孕妇,该情况显著。结论妊娠期的高血压孕妇同正常孕妇间,于临床特征以及TGF-β1基因方面所存在的差异,具有非常重要的关联。

金川牦牛TGF-β1基因克隆及蛋白质结构分析

为了探讨金川牦牛天然免疫调节因子TGF-β1基因特点,试验根据Gen Bank公布的野牦牛序列设计引物,并运用Ex PASy、ABCpred、BIMAS等生物信息学软件对基因序列进行核酸和蛋白质结构分析。结果表明：克隆的金川牦牛TGF-β1基因片段长度为607 bp,开放阅读框为471 bp,可编码157个氨基酸,其中丙氨酸、脯氨酸的含量最多,分别达14.01%、12.10%。分子质量为16.324 87 ku,理论等电点为9.48,不稳定系数为63.90。二级结构以无规则卷曲为主（64.33%）。TGF-β1基因存在潜在的抗原表位,B细胞有77-92,99-114,121-136等17个表位区域,T淋巴细胞有2-10,19-27,68-76,126-134等20个表位区域。系统进化分析中,金川牦牛TGF-β1基因与野牦牛同源性为96.7%,亲缘关系最近。试验获得金川牦牛TGF-β1基因,在哺乳动物中具有较高的保守性。

妊娠期高血压疾病的临床特征与TGF-β1基因核苷酸多态性观察

目的:对比妊娠期高血压组与正常孕妇组之间,在TGF-β1基因方面的差异,从而进一步探索TGF-β1基因核苷酸多态性对妊娠期高血压疾病的影响。方法:选取100例正常怀孕妇女及100例患有妊娠期高血压疾病的怀孕妇女,提取其DNA样本,进行TGF-β1基因分析。对两组妇女进行妊娠临床数据检查。通过两组的临床特征对比及TGF-β1基因核苷酸多态性分布对比,分析具体的临床特征与TGF-β1基因核苷酸多态性的关系。结果:妊高症组在临床特征中的血压水平、体重指数及总胆固醇指标上明显高于正常组,妊高症组的TGF-β1基因多态性分布频率也高于正常组。结论:在对两组共200例孕妇的临床特征及TGF-β1基因核苷酸多态性分布进行对比后,发现妊娠高血压疾病患者的临床特征与TGF-β1基因核苷酸多态性分布具有十分重要的联系。

肝细胞癌组织中TGF-β_1基因mRNA和蛋白表达的研究

目的 从转录和翻译两个水平探讨转化生长因子 β1(TGF β1)在肝细胞癌 (HCC)中的表达。方法 用免疫组化技术 ,分别检测 36例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF β1及转化生长因子 β1Ⅱ型受体 (TβRⅡ )蛋白的表达 ;用原位杂交方法检测 2 6例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF β1mRNA的表达 ,并将TGF β1蛋白与TGF β1mRNA ,TGF β1mRNA与TβRⅡ蛋白进行比较。 结果 (1)肝癌组织中TGF β1mRNA、TGF β1蛋白表达均明显高于癌旁组织 (P <0 0 1) ;肝癌组织TβRⅡ蛋白表达明显低于癌旁组织 (P <0 0 1)。 (2 )肝癌组织中TGF β1mRNA与TGF β1蛋白呈正相关 ,TGF β1mRNA与TβRⅡ蛋白表达呈负相关。 结论 肝癌组织中TGF β1基因的变化发生在多个水平 ;TGF β1在肝癌发生中发挥重要作用 ;TGF β1抑制作用的减弱主要是由于TβRⅡ蛋白表达减弱引起。本研究为肝癌发病机制和基因治疗提供理论依据。

大鼠半乳糖性白内障晶状体中TGF-β_1基因的表达

目的 研究转化生长因子 β1(TGF β1)基因在大鼠白内障发生过程中的表达。方法 给 3周龄大鼠单眼球后注射 2 0 %半乳糖生理盐水诱导白内障的发生 ,运用RT PCR方法测定在不同时相大鼠晶状体中TGF β1基因的表达。结果 半乳糖注射后晶状体上皮细胞TGF β1mRNA于 8h开始上升 ,2 4h达高峰 ,是正常对照的 4倍 ,2d后迅速下降 ,4d完全恢复到正常水平。结论 在白内障形成的早期 ,晶状体细胞中TGF β1呈高表达 ,提示TGF

TGF-β_1基因修饰树突状细胞对免疫排斥反应影响的研究

目的探讨术前输注TGF-β1基因修饰的供者树突状细胞(dendriticcell,DC)对大鼠肝移植免疫排斥的抑制作用及相关机制。方法TGF-β1重组腺病毒转染供者DC,静脉输注受体大鼠,1周后建立大鼠肝移植免疫排斥模型并鉴定表达,记录存活时间,凝胶电泳迁移率试验法检测脾T细胞、Kupffer细胞NF-кB活性及相关细胞因子TNF的表达,观察移植肝排斥病理改变。结果Ad-TGF-β1-DC输注组移植大鼠的T细胞、Kupffer细胞活性及TNF表达明显低于对照组,排斥病理改变明显减轻,存活时间延长,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论TGF-β1-DC能有效降低T细胞和Kupffer细胞活性,提高移植肝免疫耐受,延长存活时间。