Veto细胞与异体组织移植

Miller 及其同事发现并命名的Veto 细胞,能持久地灭活细胞毒性T 前体细胞(CTLP)或CD_4(+)辅助性T 前体细胞(T_HP),特异性地保护与自身具相同组织相容性抗原(MHC-Ⅰ、minor-H 或MHC-Ⅲ)的细胞不被识别与杀伤,被认为是维持自身耐受、诱导移植耐受的主要机理之一。目前认为Veto 细胞属非T 非B 细胞.是一种具有分化潜能的前体细胞,表型类似NK 前体细胞(pre-NK)。非特异性丝裂原或淋巴因子可提高组织细胞的Veto 活性.移植前输注与供体带相同组织相容性抗原的Veto 细胞,可明显提高组织器官移植的植活率,展示了Veto 细胞在异体组织移植中良好的应用前景。

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。

人用Vero细胞狂犬病纯化疫苗安全性观察及免疫效果分析

目的 观察杭州市新引进的常州延申生物技术有限公司生产的人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗与法国安万特巴斯德公司生产的狂犬病纯化疫苗(维尔博)的接种安全性和血清学免疫效果。方法 在杭州市疾病预防控制中心犬伤门诊选择于2 0 0 3年7月7～19日间接受狂犬病暴露后免疫者共176人作为观察对象,按接种疫苗类别分为常州狂苗组与维尔博组。按照《预防接种手册》判定标准,国家药品临床管理规定和中国生物制品规程(2 0 0 0年版)狂犬病疫苗免疫检测标准观察免疫接种后全身、局部反应和抗体水平。结果 两组疫苗接种后均无异常反应,常州狂苗组与维尔博组轻度全身反应分别为3 4 1%和3 5 7% ,IgG抗体阳转率均为10 0 % ,GMT分别为4 8 0 9IU/ml和5 2 2 2IU/ml。两组间安全性及免疫学效果差异无显著性。结论 两类人用Vero细胞狂犬疫苗使用安全、无异常反应,副反应率低。

小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体试验条件的优化

目的优化小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的试验条件。方法用含吸附白喉类毒素的制品免疫NIH小鼠,35d后眼眶采血,分离血清,对用小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的试验条件进行优化。结果确定了小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的最佳试验条件。结论优化试验条件的小鼠-Vero细胞测定白喉类毒素抗体的方法,能客观准确地评价白喉类毒素免疫保护效力,且具有特异、灵敏、重复性好的特点。

一种新的大肠埃希菌O157∶H7 vero细胞毒素的纯化及特性分析

目的研究出血性大肠埃希菌的vero细胞毒素。方法通过超声破碎,硫酸铵沉淀及两次离子交换层析,再经过凝胶过滤,最终从大肠埃希菌O157∶H7 882364菌株获得了一种新的vero细胞毒素。对此毒素进行细胞毒性测定和分子量及等电点的测定,并对毒素的N端15个氨基酸序列进行了检测。结果用凝较过滤层析测定纯化的vero细胞毒素分子量为43KD,等电点为3.8,蛋白N端15个氨基酸序列为SFELPALPYAKDALA,其对vero细胞的CD50为4bg。结论这种毒素与VT1毒素和VT2毒素明显不同,因此初步确定为新毒素,称之为VT3。通过实验将推动我国对出血性大肠埃希菌O157∶H7的致病性研究和对VT类毒素和抗毒素的进一步研制和应用。

生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究

目的研究生物反应器大规模培养Vero细胞生产疫苗细胞生长代谢与限制因素。方法采用微载体培养系统进行细胞培养,同时进行细胞记数、消化和贴壁实验。结果细胞培养过程中测得饱和溶解氧浓度系数(Cm)为0.197mM,体积氧解析系数(K1a)为0.0158min-1,同时随着葡萄糖消耗、乳酸生成,细胞停止生长并开始死亡。结论利用生物反应器培养细胞时细胞代谢与细胞密度、搅拌速率、温度通气流量、葡萄糖消耗、乳酸生成等有直接关系。

李斯特菌侵染Vero细胞诱发磷脂酶D活性的变化

目的观察在李斯特菌侵染下Vero细胞内磷脂酶D(PLD)活性的变化,为研究PLD在李斯特菌内化侵入Vero细胞过程中的具体激活机制及功能提供一定的理论基础。方法将李斯特菌以不同侵染比(MOI,细菌数:细胞数)及不同侵染时间刺激Vero细胞,应用侵染实验和PLD活性测定方法观察李斯特菌侵染量及Vero细胞内PLD活性的变化。结果当MOI为100:1时李斯特菌侵染量为(99.0±2.6)个,当MOI增加到200:1、400:1时,李斯特菌侵染量分别增加到(150.0±2.6)个和(220.0±1.0)个,并且当MOI值为200:1和400:1时与Vero细胞内基础活性相比,PLD活性均升高近2倍(P<0.05)。当侵染时间为30min时,李斯特菌的侵染量为(102.0±3.0)个,当侵染时间增加到60min和90min时,李斯特菌侵染量分别增加到(185.0±1.7)个和(346.0±4.6)个。李斯特菌侵染15min后,与Vero细胞内PLD基础活性相比升高了大约160%(P<0.05);随着剌激时间的延长,PLD的活性随之升高。结论建立了李斯特菌内化侵入Vero细胞的模型,证实李斯特菌内化侵入Vero细胞对其吞噬的过程中确实伴有PLD的激活。

地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA试验条件的改进

目前，应用地高辛标记探针检测Veto细胞残余DNA含量仍是最常用的检测方法，该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点。在实际操作中，地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响。为此，我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索。

河南省首次从人体内分离出E.coli O26∶H11

目的研究一株从腹泻病人体内分离出的E.coliO26∶H11。方法血清凝集采用玻片法,生化鉴定采用VITEK32全自动细菌分析系统GNI+卡进行鉴定,并对该株E.coliO26∶H11进行多重PCR鉴定、Vero细胞毒性试验、ESBL试验和21种抗生素的药敏试验,并结合NCCLS标准进行判定。结果血清凝集反应中O26抗原和H11抗原都呈强凝集,且不自凝;生化反应呈现大肠杆菌的典型反应;rfpO157基因、stx1基因和stx2基因均为阴性,hlyA基因和eaeA基因为阳性;Vero细胞毒性试验阴性;ESBL试验阳性;对多种抗生素具有耐药性。结论该株E.coliO26∶H11为一不产类志贺氏菌毒素的菌株,但ESBL阳性,具有多重耐药性。

转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较

分别用15L转瓶与15L生物反应器微载体（2．5g／L CytodexⅢ）系统培养Vero细胞并接种乙型脑炎病毒（简称乙脑病毒）。转瓶培养Vero细胞7～8d，细胞数最高能达到8×10^8；当单层细胞长至3．0—4．5×10^8时接种乙脑病毒，病毒滴度能达到6．5～6．98Ig PFU／ml，并能够连续收获4～5次；采用微载体系统培养Vero细胞，细胞密度最高能达到170×10^8；当单层细胞长至60～70×10^8时接种乙脑病毒，病毒滴度能达到7～7．51gPFU／ml，并能够连续收获13～15次。两种方式培养的乙脑病毒收获液分别经灭活、浓缩、柱层析纯化后制备Vero细胞乙脑纯化疫苗，各项检定指标均符合《中国药典》的相关要求。

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法:采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID50法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC50值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)的促增殖作用以及对HepG2细胞(人肝癌细胞)、HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)的生长抑制作用。结果:与公布的相关序列比较,所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC50为3.14μg。1.0-20.0mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0-20.0mg/LrSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。

风疹病毒山东地方株的分离与鉴定

目的 了解山东省风疹病毒流行情况 ,进行风疹野病毒山东地方株的分离、鉴定。方法 2 0 0 1～ 2 0 0 2年 ,从我省的济宁、淄博、济南、德州市风疹爆发流行中 ,采集 5 3份具有风疹典型症状患者的咽拭子 ,经Vero ,RK-13 ,BHK-2 1,MK2 细胞分离培养 ,选出有明显的细胞病变株。结果 在Vero细胞上对HSV - 1病毒攻击呈干扰现象 ;风疹免疫荧光阳性者 ;共分离出 9株风疹病毒山东地方野毒株 (SDRV) ,代码为SDRV1、2、3、4、5、6、7、8、9。结论 细胞用于风疹病毒的分离培养 ,免疫荧光实验可作为风疹病毒鉴定。

肾综合征出血热双价纯化疫苗的稳定性试验

将检定合格的连续三批肾综合征出血热双价纯化疫苗(Vero细胞) 2～8℃放置3、6、1 2、1 8、2 4、30月和37℃放置7、1 4、2 1、2 8天,对其稳定性进行系统试验。从疫苗的外观、pH值变化及疫苗免疫家兔后的中和抗体水平检验疫苗的稳定性。结果表明三批疫苗具有良好的稳定性。

河南省一株SARS冠状病毒的分离与鉴定报告

目的细胞培养分离新型“SARS冠状病毒变异株”。方法采用Vero细胞组织培养方法获得河南一株SARS冠状病毒分离株,应用核糖核酸(RNA)和逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行病毒鉴定。结果在5个PCR扩增物中出现强阳性反映带;该毒株与北京SARS—CoVBJO1株进行DNA序列比较,在相应区域共2170bp的DNA序列比较,序列同源性为99.5%。结论证实该病毒是我省首次成功分离到一株新型SARS冠状病毒变异株。

柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及新城疫病毒抑制作用的初步研究

目的:初探柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用及其机制,温度、酸碱度对提取物作用的影响;观察柠檬提取物对新城疫病毒的抑制作用。方法:利用滤纸片扩散法测定不同提取物浓度的相对抑菌活性,不同温度、酸碱度环境提取物相对抑菌活性。利用Vero细胞为载体观察提取物对新城疫病毒的抑制作用。结果:柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有显著的抑菌活性,其活性不受酸碱度影响,但受温度影响;提取物对新城疫病毒具有直接抑制作用,对该病的预防及治疗作用则不明显。结论:柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及新城疫病毒均具抑制作用。

微载体预处理方式对其灭菌温度及Vero细胞贴壁率的影响

目前,商品化的微载体多以干粉状态储存和销售,在细胞培养前需要先进行预处理,即用无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)溶液对干粉微载体进行水合吸胀和洗涤,然后将水合吸胀后的微载体进行高压蒸汽灭菌处理,之后才能够用于细胞的培养.在这个过程中,可能会对微载体产生影响,从而影响细胞的贴壁和生长.作者将Cytodex1微载体用无Ca2+、Mg2+的PBS以50、25、16.7 g·L-13种水合吸胀质量浓度,每种浓度以720、2 400、6 000 mL 3种装量进行预处理.然后置于高压灭菌器中进行121℃高压蒸汽灭菌,观察其水合吸胀浓度及装量差异对灭菌温度造成的影响.灭菌完成后取样对微载体进行显微镜观察,然后将各组微载体样品用于Vero细胞的7 L生物反应器培养,12 h后记录各组的贴壁率.实验证明,对微载体进行预处理时,不同水合吸胀质量浓度和装量会对其灭菌时的升温速率造成影响.预处理时水合吸胀质量浓度不超过50 g·L-1,121℃以上灭菌时间不超过212 min,对Cytodex1微载体物理特性和Vero细胞的贴壁率没有影响(P>0.05).同时,在利用生物反应器培养Vero细胞时,除了考虑微载体的水合吸胀浓度和灭菌温度差异对细胞贴壁率的影响外,更重要的是预处理时不同水合吸胀浓度和装量所造成的灭菌温度差异是否能够满足无菌控制的要求.

弓形虫侵入细胞过程中宿主胞内游离钙和胞外花生四烯酸的变化和来源

目的探讨刚地弓形虫侵入不同类型传代细胞过程中宿主胞内游离Ca^2＋和胞外花生四烯酸（AA）的变化和来源。方法采用核素液闪仪和激光共聚焦显微镜检测刚地弓形虫RH株侵入Veto和J774A.1细胞过程中宿主胞外AA和胞内游离Ca^2＋的变化及来源。对所获数据进行方差分析和t检验。结果弓形虫侵入J774A.1和Vero细胞后，宿主胞内游离Ca^2＋有不同程度升高，其最高荧光强度变化分别为（1219．7±58．4）％（t=4.982，P〈0.01）和（356.3±23．6）％（t=2.593，P〈0.05）。Vero细胞内Ca^2＋升高多来源于胞内Ca^2＋库释放，而J774A.1细胞内Ca^2＋升高来源于胞内Ca^2＋库释放和胞外Ca^2＋内流。弓形虫侵入Vero和J774A.1细胞后，宿主胞外AA均明显升高，分别为感染前的5.02倍和8.44倍（t=3.124，t=3.852，均P〈0.01）。磷脂酶怠抑制剂作用弓形虫后可明显抑制AA升高。结论弓形虫感染吞噬性细胞激活宿主胞膜磷脂酶C和弓形虫磷脂酶A2，引起宿主胞内游离Ca^2＋和胞外AA浓度升高，两者共同作用导致虫体侵入；虫体侵入非吞噬性细胞可能仅激活虫体磷脂酶A2。

Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果观察

目的观察Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果。方法选择乙脑低发区黑龙江省肇源县8月龄～10岁常住健康儿童为观察对象,按照免疫程序分别接种辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗(A组∶水针剂型;B组:冻干剂型)和市售乙脑灭活疫苗(对照组),观察接种后的不良反应,并采用蚀斑减少中和试验(PRNT)法检测血清乙脑中和抗体。结果A、B组疫苗的总不良反应率为2.81%,对照组为6.63%,3组均未出现严重不良反应,发热反应以轻度为主,局部不良反应较轻微,72h后全部消失。免疫后血清中和抗体阳转率A组为93.3%,B组为90.4%,对照组为81.8%;GMTA组为1∶24.0,B组为1∶21.8,对照组为1∶15.4。A组、B组的中和抗体阳转率和GMT均显著高于对照组,差异有统计学意义,3组之间中和抗体滴度的分布差异无统计学意义。结论辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗不良反应率低,免疫效果良好。

磁珠法结合定量PCR检测肠道病毒71型灭活疫苗中宿主细胞DNA残留量的验证及应用

目的对磁珠法结合定量PCR（quantitative PCR，qPCR）检测肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）（EV71疫苗）中宿主DNA残留量进行适用性验证及应用。方法利用微磁珠与蛋白溶液中DNA的特异性结合，来提取样品中残留的宿主细胞DNA。将已知浓度的细胞DNA对照系列稀释后，作为标准品DNA与提取的DNA同时进行qPCR扩增。根据标准品DNA的循环阈值与浓度之间的线性关系，对未知样品中残留DNA进行定量分析。结果标准品检测范围在0．03～3000．00Pg／反应。该方法的标准曲线决定系数≥O．980，扩增效率为90．O％～110．00。质控样品回收率为50％～150％，相对标准偏差均小于30％。实验结果的各项参数均在要求范围内。结论磁珠法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点，qPCR能够简便、快速、准确地对EVTl疫苗生产过程中的DNA残留量进行定量测定。该法适用于EV71疫苗中DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制，对其他采用同样细胞基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。