上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系

上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系成立于2017年6月,由原解剖学与组织胚胎学系中的组织胚胎学学科、原分子发育生物学研究室、原发育生物学研究室及原医学遗传学教研室重组而成。为培养有灵魂的卓越医学创新人才,上海交通大学医学院广泛开展课程整合改革,建立了价值引领、知识探究、能力建设、人格养成的新的整合课程体系。医学遗传学和组织学与胚胎学是医学基础必修的主干整合课程,承担包括国家级精品课程组织胚胎学和上海市精品课程医学遗传学在内的5门医学基础课程18个教学班的本科教学任务,同时开设包括发育生物学基础与进展、医学遗传学基础与进展、生殖生物学理论及相关技术等在内的研究生课程。

医学实验室试剂管理系统的构建与实践

为实现医学实验试剂管理的信息化、网络化建设,以提升医学实验室管理质量和能力,设计了一套医学实验室试剂管理系统。该系统集成了基础设置、试剂入库、试剂出库、库存管理模块,通过钉钉平台及氚云开发工具实现低成本、定制化的管理功能定制。该系统的构建遵循CNAS按照国际标准ISO15189:2022对医学实验室质量和能力认可的要求,实现了自助扫码出库、过期与低库存预警、多仓库管理和多项目独立管理等功能,兼具开发周期短、管理高效、便于维护等特点。实践表明,该系统可以满足医学实验室教学、科研工作中试剂管理的需求以及精准实验室标准化的管理要求,并在医学实验室试剂管理中起到了良好示范作用,为实验室其他应用场景提供有益借鉴。

基于CRISPR/Cas9n技术建立携带mT-F2A-EGFP报告系统的小鼠胚胎干细胞系

目的·通过CRISPR/Cas9n(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nickase)介导的同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)技术在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)的中内胚层关键调控分子T-box转录因子Brachyury(即T基因)末端依次敲入手足口病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A,F2A)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以建立T荧光报告细胞系(mTF2A-EGFP)。方法·首先,针对T基因构建特异性单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)质粒和包含F2A-EGFP的供体质粒。利用电穿孔将这2种质粒递送到mESC E14Tg2a(E14)内,通过HDR在T基因末端插入F2A-EGFP。然后,通过药物筛选和基因测序验证所获得的单克隆细胞,并将其诱导形成类胚体(embryonic body,EB)进行分化。通过荧光显微镜和流式细胞技术分别监测mT-F2A-EGFP细胞克隆在分化前后的荧光信号变化,并进行实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)来检测多能性标志基因、中内胚层以及外胚层标志基因的转录水平变化。同时,检测克隆细胞的周期、生长曲线,并利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色检测候选克隆干细胞特性。最后,挑选克隆细胞系T1进行了EB分化。利用流式细胞技术分选出分化细胞群中EGFP荧光表达细胞(EGFP+)和无荧光表达的细胞(EGFP-),并检测各谱系基因的表达情况。结果·EGFP被正确插入到E14细胞的T基因,其荧光强度能正确反映T基因表达水平且未产生明显的不良反应。当T1报告克隆分化时,通过流式细胞技术分选出的包含mT-F2A-EGFP的荧光细胞主要高表达中内胚层标志基因。结论·成功构建携带mT-F2A-EGFP的mESC,可实现对T基因调控程度的快速监测,并实时追踪分化过程中表达T基因标记EGFP的中内胚层细胞。

人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox)调控的多基因CRISPR 干扰系统。该系统主要由2 个质粒组成:1 个质粒在Dox 调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR 相关蛋白9(nucleasedeactivatedCRISPR-associated protein 9,dCas9)和Krüppel 相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另1 个质粒可同时表达8 个独立的导向RNA(guide RNA,gRNA)来分别引导dCas9-KRAB 蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组DNA 为模板进行PCR,确定2 个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting 确定细胞在Dox 诱导下是否可表达dCas9-KRAB 蛋白。结果·使用这种可调控的多基因CRISPR 干扰系统,可在Dox 诱导下在hESCs 中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致hESCs 形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs 表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原4(stagespecificembryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降,hESCs 发生分化。结论·该CRISPR 干扰系统可以在hESCs 中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具。

小鼠胎肝单个核细胞行骨髓腔内注射重建造血系统的效果

目的·观察用小鼠胎肝单个核细胞悬液行骨髓腔内注射以重建小鼠造血系统的效果。方法·用Ficoll分离技术获取胎龄13.5 d的小鼠胎肝单个核细胞悬液,采用磁珠分选的方法获得造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)并计数。以骨髓腔内注射的方法对137Cs辐射清髓后的小鼠胫骨进行小鼠胎肝单个核细胞移植。对移植后的受体小鼠通过血常规检测、血涂片及骨髓涂片镜检的方法观察造血系统的重建情况。对受体小鼠移植后1年骨髓中的供体HSC进行流式细胞检测。结果·胎龄13.5 d的小鼠胎肝单个核细胞中HSC占0.171%。小鼠胎肝单个核细胞移植后1周,外周血即能探测到供体细胞来源的血细胞;移植后第3周受体小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白基本恢复至辐照前水平;第5周外周血中供体细胞来源的血细胞比例趋于稳定;移植后1年受体小鼠骨髓中的HSC基本来自供体细胞。结论·小鼠胎肝单个核细胞通过骨髓腔内注射的移植方法能高效重建小鼠造血系统。

2类小鼠胎肝基质细胞的生物学特征及表达谱分析

目的·探究不同类型小鼠胎肝基质细胞在细胞形态、分子特征和生物学功能上的差异。方法·通过体外贴壁培养的方式获取13.5 d小鼠胎肝基质细胞,根据细胞形态及其表面标志物CD44、CD29、CD106、CD45及Sca-1的表达差异,区分不同的细胞类型。使用小鼠基因组阵列4302.0基因芯片在P<0.05、差异倍数>3或<-2的标准下筛选差异基因,并使用IPA(ingenuity pathway analysis)软件对典型信号通路和生物学功能进行分析。结果·依据细胞形态的不同,分离出2类胎肝基质细胞,即短梭形细胞(CD45^+CD106^-CD29^+CD44^+Sca-1-)和成纤维样细胞(CD45^-CD106^+CD29^+CD44^+Sca-1^-)。前者共筛选出1485个高表达基因,主要参与免疫炎症相关的信号通路;后者共筛选出3374个高表达基因,主要参与细胞外基质形成及细胞间黏附。结论·小鼠胎肝基质细胞在生物学特征及功能上具有较强的异质性,在促进造血干细胞的增殖方面可能存在差异。

双同源盒诱导小鼠胚胎干细胞向胚外内胚层分化的机制研究

目的·探索双同源盒(double homeobox,DUX)蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)向胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)分化潜能的影响及可能的作用机制。方法·使用慢病毒体系在mESC中构建过表达DUX细胞系,利用流式细胞术检测DUX过表达前后2细胞样细胞(2-cell-like cell,2CLC)的比例,并使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测2细胞期特异性基因,如内源性Dux、锌指和SCAN结构域的蛋白质4c(zinc finger and SCAN domain containing 4c,Zscan4c)、锌指蛋白352(zinc finger protein 352,Zfp352)和鼠内源性反转录病毒-聚合酶(murine endogenous retrovirus-L polymerase,MERVL-pol)的表达。RT-qPCR检测过表达DUX的mESC多能性因子[nanog homeobox(Nanog)、kruppel-like transcription factor 4(Klf4)、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,Sox2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)]和自然分化状态下各胚层标志性基因[内胚层(endodermal):GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,Gata4)、Gata6、Sox17;外胚层(ectodermal):微Ⅲ型β微管蛋白3(tubulin beta 3 classⅢ,Tubb3)、巢蛋白(Nestin);中胚层(mesodermal):心脏和神经嵴衍生物表达转录本1(heart and neural crest derivatives expressed 1,Hand1)、肌源性分化蛋白1(myogenic differentiation 1,Myod1)、激酶插入结构域受体(kinase insert domain protein receptor,Flk1)]的表达。挖掘公共转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据,通过分析胚外内胚层标志基因的表达水平,明确DUX对mESC向胚外内胚层分化的影响;通过对差异基因的功能及通路进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),找出DUX作用的信号通路;深入分析已有的染色质免疫共沉淀技术结合二代测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据,探究DUX的潜在靶基因。结果·2CLC比例升高和2细胞期标志基因表达上调,证明已成功构建过表达DUX细胞系。分子生物学实验显示过表达DUX后可有效维持mESC的多能性,与公共RNA-seq数据分析结果一致;差异基因分析发现,内胚层基因出现特异性上调;诱导mESC自然分化后,RT-qPCR检测实验表明XEN标志基因(Gata4、Gata6、Sox17)的mRNA表达出现显著上调(P<0.001),而中胚层、外胚层基因没有特异性变化。GSEA结果提示DUX可能激活了视黄醇代谢信号通路,ChIP-seq数据解析进一步揭示在DUX结合的peaks中存在已知的视黄酸受体motif,可激活下游与XEN发育相关的靶基因。结论·DUX与视黄酸信号通路密切关联,预示其激活了视黄酸信号通路,促进mESC倾向XEN分化。

将晚年“安宁”交还给老年人

近日,深圳在“临终决定权”上做出了大胆突破,深圳市七届人大常委会第十次会议表决通过的《深圳经济特区医疗条例》修订稿将“生前预嘱”写入了地方性法规,将临终尊严交还给个人。除了临终一刻的尊严,在生前或多或少的一段时间内,尊重病人的意愿,让其通过安宁疗护,平静地走完最后时光,更是现代社会、法律和伦理赋予人类的新概念。

TGF-β2调控血管平滑肌细胞表型转化在静脉血栓管壁重塑中的作用及其机制

目的探讨静脉血栓后管壁重塑过程中转化生长因子β2(TGF-β2)调控血管平滑肌细胞(SMC)表型转化的作用及其机制。方法用0、1、10、20 ng/ml TGF-β2刺激人脐静脉平滑肌细胞(HVSMCs)24 h,以及10 ng/ml TGF-β2刺激HVSMCs 0、2、6、24 h,分别提取RNA,采用RT-PCR检测HVSMCs表型标志物(收缩型:α-SMA和Elastin;合成型:Col1A1和Col1A2)mRNA的表达。建立SD大鼠下腔静脉血栓模型,将大鼠随机分为假手术组(n=5)、血栓组(n=9)和TGF-β2实验组(n=5)。造模后第4天和第7天,采用HE和Masson染色进行验证。造模后第14天,用含TGF-β2(10 ng/只)的水凝胶在血栓局部处理24 h,采用RT-PCR检测各组静脉管壁SMC表型标志物mRNA的表达。结果TGF-β2可上调HVSMC收缩型和合成型标志物mRNA的表达且呈剂量和时间依赖性(P<0.05),其中对收缩型标志物mRNA表达的上调作用更为明显。HE和Masson染色显示急性期(造模后第4天)血栓形成和慢性期(造模后第7天)血栓机化再通,证实下腔静脉血栓造模成功。造模后第14天,与假手术组比较,血栓组静脉管壁SMC收缩型标志物mRNA的表达明显下调,合成型标志物mRNA的表达明显上调(P<0.05)。在血栓局部使用TGF-β2处理后,收缩型标志物mRNA的表达上调更为明显(P<0.05)。结论TGF-β2可诱导HVSMC收缩型和合成型标志物的表达,其中对收缩型标志物的上调作用更为明显。在大鼠下腔静脉血栓模型中,TGF-β2可明显上调SMC收缩型标志物的表达,有利于维持血栓段静脉管壁SMC的收缩表型。

MUC1在HER2阳性乳腺癌发病中的作用及机制研究

目的·研究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌发病中的作用及其调控的分子机制。方法·使用病毒感染技术构建MT2/MUC1诱导表达细胞株和MT2/Vec及MT2/CD过表达细胞株;采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测过表达MUC1和MUC1-CD后6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)的蛋白质表达水平;通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验和肿瘤细胞成球实验,研究MUC1对HER2阳性乳腺癌细胞MT2增殖、克隆形成、迁移和成球的影响;使用GP6D的抑制剂6-AN抑制酶活性,CCK-8检测乳腺癌细胞增殖;采用GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库分析HER2、MUC1和G6PD在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌患者生存期的影响。结果·过表达MUC1或MUC1-CD促进HER2阳性乳腺癌细胞MT2的增殖、克隆形成、迁移和成球,并且提高G6PD的蛋白质表达水平。抑制G6PD活性显著降低MUC1和MUC1-CD诱导的细胞增殖。G6PD蛋白在乳腺癌组织中表达上调且与乳腺癌患者生存期缩短相关。结论·MUC1可能通过调控G6PD的表达促进HER2阳性乳腺癌的进程,提示抑制磷酸戊糖途径可能成为HER2阳性乳腺癌治疗的靶点。

与MUC1共同调控肿瘤化疗耐药的MUCIN家族成员的筛选

目的·在黏蛋白(MUCIN)家族成员中,筛选与黏蛋白1(mucin 1,MUC1)协同调控肿瘤细胞化学治疗(化疗)耐药的蛋白。方法·利用2对细胞系(紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR-CasCTL和MUC1敲除细胞HeLa229/TR-CasMUC1,母本细胞HeLa229/P和紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR),应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测MUCIN家族成员的mRNA表达水平,分析其与MUC1表达的相关性;通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测筛选出的MUCIN家族成员的蛋白表达水平,以筛选出在mRNA和蛋白水平均与MUC1表达存在相关性的靶蛋白;通过短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)方法沉默靶基因,利用药物半抑制浓度(half-maximum inhibitory concentration,IC^(50))实验检测细胞耐药性的变化;进一步利用GEPIA数据库分析多种肿瘤组织中MUC1和MUC13的平均表达水平;采用R2数据库分析在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌组织中MUC1与MUC13表达的线性相关性;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析MUC1和MUC13的表达与胃癌患者生存率的关系。结果·qPCR检测结果显示,在MUCIN家族成员中,与MUC1在mRNA水平存在相关性的有MUC13和MUC18;Western blotting检测结果显示,在蛋白水平,只有MUC13随着MUC1的上调而上调,随着MUC1的敲除而下调;IC^(50)实验结果显示,随着MUC13的沉默,肿瘤细胞对紫杉醇的IC^(50)明显下降。进一步利用GEPIA数据库分析发现,在多种肿瘤组织中MUC1与MUC13存在同时高表达或低表达的特点;通过R2数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌肿瘤组织中呈正相关;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量与胃癌患者的生存率呈负相关。结论·MUC1与MUC13在肿瘤细胞化疗耐药中存在协同作用,同时与肿瘤患者的生存预后密切相关;临床上联合抑制MUC1和MUC13在肿瘤细胞化疗耐药治疗上具有可行性。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

基于CRISPR/Cas9技术的β-地中海贫血和血友病基因治疗研究进展

地中海贫血和血友病是由基因异常引发的常见的遗传性血液病,难以根治且可遗传给下一代,造成严重的家庭和社会负担。基因治疗的出现为遗传性疾病提供了新的治疗方案,但自1990年第1项基因治疗临床试验被批准以来,30年间基因治疗的发展并不乐观。随着基因编辑技术的发展,尤其具有编辑效率高、操作简单、成本低等优势的第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)的发展,基因编辑介导的基因治疗越来越受到关注,有望根治地中海贫血和血友病等遗传性血液病。本文综述了近6年(2014~2020年)基于CRISPR/Cas9技术的β-地中海贫血和血友病基因治疗基础研究进展,总结了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗临床试验概况,并对CRISPR/Cas9技术用于基因治疗存在的问题和可能的解决方案进行探讨,以期为基于CRISPR/Cas9技术的遗传性血液病基因治疗相关研究提供参考。

多能干细胞关键因子Oct4 RNA结合蛋白的分离与鉴定

目的·分离多能干细胞关键因子Oct4的RNA结合蛋白。方法·培养小鼠胚胎干细胞(R1),从中提取细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增Oct4并转录为m RNA。采用链霉素亲和层析和质谱技术筛选候选RNA结合蛋白,采用RNA免疫沉淀技术鉴定候选RNA结合蛋白。结果·经高效液相色谱-质谱法鉴定和筛选出121个能与Oct4 3'非翻译区(untranslated region,UTR)和Oct45'UTR相结合的RNA结合蛋白,肽段图谱匹配数≥2的有11个。并对其中的7个候选RNA结合蛋白进行了进一步验证,结果显示Oct4可与DSP、SOD1、LMNA、NPM1、PSIP1、NCL和HDGF蛋白发生相互作用,其中HDGF与Oct4结合能力最强。结论·Oct4RNA结合蛋白的鉴定将为Oct4的调控机制提供一定理论依据,为后续其功能研究提供基础。

急性缺血性脑卒中患者血清肾胺酶表达特征及临床意义

目的·分析急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者血清肾胺酶(renalase)的水平变化及其在病情评估中的作用。方法·选取上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科2020年7月—2021年11月收治的118例AIS患者为病例组(AIS组)。根据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评估患者的神经功能缺损情况,并将患者分为轻度神经功能缺损和中重度缺损。选取同期该院体检中心参与体检的健康者133例为对照组。采用ELISA法检测2组血清肾胺酶水平。采用Spearman等级相关性分析评估AIS患者血清肾胺酶水平与性别、年龄、空腹血糖、血脂、NIHSS评分之间的相关性。绘制受试者操作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线),分析血清肾胺酶水平对AIS的诊断价值。将单因素Logistic分析结果中有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归模型。结果·AIS组血清肾胺酶水平为2960.01(1557.99,4053.70)pg/mL,高于对照组的821.02(391.29,1752.70)pg/mL,差异有统计学意义(P=0.000)。Spearman相关性分析显示,AIS患者血清肾胺酶水平与NIHSS评分呈负相关(r=-0.216,P=0.019),与空腹血糖呈正相关(r=0.200,P=0.030),与性别、年龄、低密度脂蛋白水平、胆固醇水平及是否患高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)无明显相关性。轻度神经功能缺损AIS患者血清肾胺酶水平高于中重度患者,差异有统计学意义(P=0.034)。ROC曲线显示,血清肾胺酶水平诊断AIS的截断值为1856.49 pg/mL,曲线下面积为0.777±0.030,其95%CI为0.718~0.836(P=0.000)。多因素Logistic回归分析显示,血清肾胺酶水平升高[>1856.49 pg/mL,比值比(odds ratio,OR)=6.980,P=0.000]、高血压(OR=5.382,P=0.000)、糖尿病(OR=2.453,P=0.040)是发生AIS的危险因素。结论·AIS患者血清肾胺酶水平显著升高,并与NIHSS评分呈负相关。血清肾胺酶可作为AIS辅助诊断和病情评估的潜在生物标志物,为脑卒中病情进展评估及精准化治疗提供新的策略。

伐地那非预处理对精子冷冻效果的影响

目的·探索伐地那非预处理对精子冷冻复苏后活力的影响。方法·在上海市人类精子库随机收集30例捐献者的精液标本,并将收集的每例精液平均分成6份,1份用于冷冻前指标测定,其余5份分别用0、0.4、4.0、40.0、400.0μg/mL的伐地那非孵育5 min。按精液与保护剂2:1的比例添加保护剂,采用一步熏蒸法进行冷冻,冷冻复苏后分别检测每份标本的前向运动精子、精子活力及正常精子形态等参数。结果·复苏后,0、0.4、4.0、40.0、400.0μg/mL伐地那非处理后的前向运动精子百分率分别为(41.47±9.80)%、(42.57±9.60)%、(47.77±8.55)%、(37.27±8.47)%、(26.37±6.99)%。与对照组(0μg/mL伐地那非组)比较,4.0μg/mL伐地那非处理后的精子复苏后活力有显著改善,差异有统计学意义(P=0.034)。结论·适当浓度的伐地那非预处理精液能提高精子冷冻复苏后的活力;然而伐地那非浓度过大,可能对精子有毒害作用。

血清孕酮水平检测在克隆胚胎移植受体牛的筛选及妊娠诊断中的应用

目的:孕酮(progesterone,P4)作为一种生殖激素,在牛的发情期和妊娠期呈规律性变化,且在妊娠的建立和维持过程中发挥着重要作用。拟应用孕酮浓度测定辅助人工观察筛选克隆胚胎移植受体牛并监测其整个妊娠过程。方法:通过对自然配种牛不同生殖阶段血液中孕酮水平的分析,建立其在发情初期、妊娠期孕酮浓度的变化规律,以此为依据辅助人工观察筛选适合胚胎移植的受体牛。同时将在体外培养7天后的体细胞核移植重构囊胚移植到所筛选出的同期发情的受体牛子宫内,并应用孕酮测定监测其妊娠状态。实验结果:(1)运用孕酮检测筛选克隆胚胎移植受体牛时,当孕酮浓度在发情第0天和第5天分别为≤0.64nmol/L和2~8nmol/L时,适宜作为胚胎移植受体牛,根据此筛选指标能够排除50%左右假发情牛。(2)运用孕酮检测较传统的人工观察方法,胚胎移植的克隆牛出生率提高了7.1倍。结论:运用牛血清孕酮检测方法能有效提高母牛生理周期判断的准确性,有利于选择合适的胚胎移植受体牛,既能实时、有效地监测怀孕受体牛的妊娠状态,又避免了靠人工观察受体牛返情、流产时的人为疏漏和误判,有效地提高受体牛的利用率,提高克隆牛的生产效率,并能推广应用于畜牧行业牛的生产繁育中。

中胚层细胞的形成及向血系分化的研究进展

在原肠运动过程中,原条的位置上出现一类新的细胞将上胚层和下胚层分隔开,并且形成新的胚层,这层新的细胞称为中胚层。中胚层细胞将来分化为血液、骨骼、肌肉、肾脏、结缔组织、真皮、泌尿生殖系统等重要的组织和器官。其中,血液系统是维持正常生命活动的重要组成部分。血液系统形成过程受到复杂而又精细的分子调控。近年来,随着单细胞RNA高通量测序技术和生物信息学分析方法的不断发展,中胚层细胞的分子特性、命运图谱及其血系分化机理的神秘面纱被逐步揭开。

黏蛋白1调控肿瘤细胞恶性特征的功能位点分析

目的·探究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)调控肿瘤细胞增殖、迁移和干性维持的功能位点。方法·通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析寻找MUC1基因在不同癌症中的突变特征,对不同MUC1突变位点进行分析及定位,并按突变出现频率排序;通过Western blotting筛选出突变频率较高且蛋白稳定表达的MUC1突变体,利用乳腺癌细胞株BT549敲除MUC1细胞系和乳腺非转化细胞株MCF-10A,应用慢病毒表达系统构建MUC1野生型(MUC1-WT)和突变体稳定表达的细胞系。采用免疫荧光法检测不同MUC1突变体的细胞定位。以MUC1-WT为阳性对照、MUC1-AQA功能丧失突变体为阴性对照,对不同突变细胞的肿瘤生物学功能进行分析:通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)及克隆形成实验检测细胞增殖能力;通过划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力;通过成球实验检测细胞干性。使用PyMOL软件分析MUC1突变体结构定位并通过蛋白质对接软件(ZDOCK Server)进行分子对接分析。结果·在TCGA数据库中得到102个位于MUC1编码区的突变,其中P418S、S251R、V359I、N271S、N465H 5个错义突变出现频率较高且位于非数目可变串联重复序列(non-variable number of tandem repeats,non-VNTR)区域。进一步检测发现MUC1-S251R、N271S、V359I突变体可稳定表达;细胞定位分析发现这3个突变体主要分布于细胞质,同时细胞核也有一定的分布,核质比与野生型未见明显差异。表达不同MUC1突变体细胞的肿瘤生物学功能分析发现:①MUC1-WT高表达显著增强BT549和MCF-10A细胞的增殖能力;与MUC1-WT细胞相比,MUC1-AQA、S251R、N271S突变体细胞增殖能力下降,但MUC1-V359I突变体细胞与MUC1-WT细胞具有相似的增殖能力。②MUC1-WT高表达细胞的迁移能力显著增强,而MUC1-AQA细胞迁移能力减弱。在BT549细胞中,MUC1-S251R与MUC1-V359I突变体细胞迁移能力与MUC1-WT细胞相似,但MUC1-N271S细胞的迁移能力较MUC1-WT细胞降低。在MCF-10A细胞中,MUC1-N271S与MUC1-V359I细胞的迁移能力接近MUC1-WT细胞;但MUC1-S251R细胞较MUC1-WT细胞迁移能力显著下降。③MUC1-WT高表达显著增强2种细胞的干性,而MUC1-AQA细胞干性丧失;MUC1-N271S、V359I与MUC1-WT具有相似的维持细胞干性的能力,而MUC1-S251R使细胞干性减弱。PyMOL软件分析结果显示,MUC1-N271S及V359I位于海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(sperm protein-enterokinase-agarin,SEA)区域及附近,分别处于loop区及β-折叠处;分子对接结果显示,MUC1-WT及V359I与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外域形成复合物的稳定性强于MUC1-N271S和S251R,其稳定性排序为V359I>WT>N271S>S251R。结论·MUC1突变体对肿瘤细胞的生物学功能具有不同影响,其对增殖能力影响可能与EGFR信号通路相关。MUC1-V359I与MUC1-WT相似,并未影响MUC1对肿瘤细胞增殖、迁移及干性维持的作用;而MUC1-S251、N271位点可能参与细胞增殖和迁移的信号通路调控且MUC1-S251位点对维持细胞干性较为重要。

一例囊性纤维化相关疾病的诊断与启示

目的对1例以慢性腹泻为主要临床表现的囊性纤维化相关疾病的男童患者进行基因诊断,探讨中国囊性纤维化确诊率低的原因。方法收集10岁患病男童的病史资料和临床表现,分析实验室检查和全外显子测序结果。结果患儿反复腹泻9年伴中度营养不良。腹部CT示胰腺萎缩。全外显子测序结果显示CFTR基因复合杂合变异,分别为已明确的致病性变异c.263T>G和未经报道的c.1514delA移码变异。结论依据囊性纤维化的诊断指南,本例患儿诊断为囊性纤维化相关疾病。该病例丰富了CFTR基因变异谱和表型谱的同时,也表明了中国人建立自有的CFTR基因变异和表型数据库的必要性。