重组链激酶在脑内血肿动物模型中的局部应用

观察重组链激酶对人凝血块的溶化作用及对脑组织的毒性反应。分别用重组链激酶（实验组）和生理盐水（对照组）注入人凝血块制成的猫额叶脑内血肿内，观察血肿溶化效果。结果：实验组１０例中６例血肿完全溶化，对照组１０例血肿均未溶化。病理组织学观察，实验组血肿周围脑组织病理改变轻于对照组。结论：重组链激酶对动物模型脑内血肿局部应用有良好的溶化人凝血块的作用，而对周围脑组织无毒性反应。

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法 从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果 琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论 成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。

锦鸡丙素对两株人肺癌细胞株蛋白激酶和同工酶活性的影响

目的 研究锦鸡丙素对两种人肺癌细胞株中不同组分的蛋白激酶C(PKC)活性及其同工酶分布的影响 ,探讨两种细胞株对锦鸡丙素的细胞生长抑制作用表现出敏感性差异的原因。方法 梯度离心法、32 P掺入法及蛋白印迹法。结果 ①A5 4 9及HCI H4 46细胞所有组分中的PKC活性均可被锦鸡丙素所抑制 ,两种细胞胞质及颗粒组分中PKC活性完全受抑所需时间相同 ,A5 4 9细胞全细胞组分及核组分所需时间均长于NCI H4 46细胞 ;②A5 4 9细胞胞质组分中PKC的活性不可逆转 ,而HCI H4 46细胞为核组分 ;③ 5 4 9细胞中主要表达PKC α、ε和ζ ,胞质中三者都存在 ,颗粒组分中只检测到α且锦鸡丙素处理后α消失 ,而胞质及全细胞组分中的α含量增加 ;NCI H4 46细胞胞质中主要存在PKC ζ和ε,颗粒组分中仅检测到PKC ζ且锦鸡丙素处理后胞质中 ζ增加而颗粒组分中则减少。结论 锦鸡丙素体内外均可抑制PKC的活性并可降低PKC α在颗粒组分中的含量使其膜转位受阻 ,但这种抑制作用与肿瘤细胞生长的抑制之间并没有直接的联系 ;PKC α可能是A5 4 9细胞信号传导系统中最主要的PKC同工酶形式 ,锦鸡丙素抑制其活性并阻碍其膜转位将可能影响A5 4 9肺癌细胞的增殖并与A5 4 9细胞对锦鸡丙素敏感性较高有着密切的关系。

二苯乙烯类化合物对肺癌细胞株生长的抑制作用

目的研究二苯乙烯类化合物（含３种结构类似的成分：（１）（＋）－α－ｖｉｎｉｆｅｒｉｎ，（２）ｍｉｙａｂｅｎｏｌＣ，（３）ｋｏｂｏｐｈｅｎｏｌＡ，一种蛋白激酶Ｃ抑制剂）对人肺癌细胞株Ａ５４９，９５－Ｄ，ＳＰＣ－Ａ－１，ＮＣＩ－Ｈ４６０及ＮＣＩ－Ｈ４４６细胞体外生长的抑制作用。方法锥虫蓝排除法、ＭＴＴ法、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８荧光染色及ＤＮＡ凝胶电泳。结果药物处理时间越长及浓度越高，细胞生长抑制作用越强，其中Ａ５４９细胞株ＩＣ５０为２０μｍｏｌ／Ｌ，敏感性最高，而ＮＣＩ－Ｈ４６０及ＮＣＩ－Ｈ４４６的ＩＣ５０为２００μｍｏｌ／Ｌ，敏感性最低；荧光染色结果为所有经药物处理的肺癌细胞的染色质均产生凝集现象，在ＤＮＡ凝胶电泳图中，出现梯状ＤＮＡ电泳条带。结论二苯乙烯类化合物可显著抑制Ａ５４９细胞的生长，且这种抑制作用表现出时间及浓度依赖性；此化合物对ＮＣＩ－Ｈ４６０及ＮＣＩ－Ｈ４４６细胞的生长未表现明显的抑制作用。另外。

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融会了ＲＧＤ３肽编码序列，通过连接、克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。结果：细胞培液中，重组水蛭素衍生物的活性达到１０ＡＴＵ／ｍｌ，并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。

大肠杆菌表达的重组人PAI-2的纯化及其生物化学特性

目的研究建立大肠杆菌表达的重组人ＰＡＩ－２（ｒｈＰＡＩ－２）的纯化方法，并对ｒｈＰＡＩ－２蛋白进行理化和生物学性质的研究。方法工程菌被高压匀浆后，经硫酸铵分级沉淀，用分子筛、离子交换和疏水性色谱进行分离，得到了ｒｈＰＡＩ－２蛋白。对ｒｈＰＡＩ－２进行了复性，对ｒｈＰＡＩ－２的温度、ｐＨ、盐浓度、氧化剂敏感性、二级速率常数及抗ＳＤＳ复合物形成等理化性质和生物学特性进行了测定。结果每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质，比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ，得率为１９．２％。当温度高至６０℃时，ｒｈＰＡＩ－２迅速失活；当ｐＨ小于３时，ｒｈＰＡＩ－２完全失活；当盐浓度和Ｈ２Ｏ２浓度分别在１．５和０．５ｍｏｌ／Ｌ时，ｒｈＰＡＩ－２的活性仍维持在９０％以上；ｒｈＰＡＩ－２可与尿激酶形成抗ＳＤＳ复合物。结论成功地从大肠杆菌中分离纯化了ｒｈＰＡＩ－２。ｒｈＰＡＩ－２与天然ＰＡＩ－２在理化性质和生物学特性上基本一致。

重组尿激酶型纤溶酶原激活物受体在酵母系统中的表达及鉴定

构建截断型可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（ｕ－ＰＡＲ）的原核及酵母表达质粒并分别在大肠杆菌和Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中高效表达．利用ＰＣＲ扩增截断型可溶性ｕ－ＰＡＲｃＤＮＡ片段，并分别连入酵母及原核表达载体中，构建成表达质粒．后者经诱导表达的蛋白被用于免疫家兔，获得抗ｕ－ＰＡＲ的抗血清，用于对酵母表达产物的鉴定．前者在甲醇的诱导下表达，产物分泌至培养液中．结果表明，原核表达的ｕ－ＰＡＲ蛋白免疫家兔后获得高效价的抗血清，利用此抗血清所作Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实酵母表达蛋白具有ｕ－ＰＡＲ的免疫原性，表观分子量４０ｋＤ左右．Ｍｕｔ－表型在第５ｄ为最高（２．５μｇ／ｍｌ），Ｍｕｔ＋表型在第４ｄ为最高（７．５μｇ／ｍｌ）．因此，构建的可溶性ｕ－ＰＡＲ表达质粒在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母细胞获得表达，为进一步竞争拮抗受体功能的研究奠定了基础．

乳腺肿瘤组织中Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂的表达

探查乳腺肿瘤组织中Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）的表达，并比较乳腺恶性肿瘤组织与良性纤继腺瘤及正常组织中ＰＡＩ－１的差异。用免疫组织化学和原位杂交的方法，确定了乳腺癌、乳腺纤维腺瘤及瘤旁正常组织中ＰＡＩ－１的分布；用发色底物法检测组织提取液中ＰＡＩ－１的活性；用图象分析的方法对组织切片上的ＰＡＩ－１进行灰度定量。结果：ＰＡＩ－１主要分布在乳腺正常腺上皮细胞、瘤上皮细胞和腺癌细胞的胞浆中，但恶性组织中的成纤维细胞、巨噬细胞以及癌旁纤维组织也有染色。癌组织中ＰＡＩ－１的活性（Ｐ＜０．００１）和含量（Ｐ＜０．００５）均高于良性乳腺纤维腺瘤及瘤旁正常组织。结论：ＰＡＩ－１在乳腺恶性肿瘤组织中明显升高，ＰＡＩ－１的检测可能为临床乳腺肿瘤的诊断、预后提供新的指标。

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。

大肠杆菌表达的重组人PAI－1的纯化

纯化了工程细菌表达的可溶态和包含体形式的ｒｈＰＡＩ－１，纯度均达９８％，其ｒｈＰＡＩ－１蛋白质得率分别为１５％和１９％，比活性分别为３３５００ＩＵ／ｍｇ和２７７０００ＩＵ／ｍｇ。Ｎ端氨基酸序列分析显示，ｒｈＰＡＩ－１Ｎ端１５个氨基酸与天然ＰＡＩ－１完全一致；包含体复性研究表明，包含体的复性与复性蛋白的浓度及复性液中助溶剂的浓度密切相关。纯化的ｒｈＰＡＩ－１为分析ＰＡＩ－１结构与功能及探讨其临床应用提供了材料。

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

建立Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡⅠ－１）ｃＤＮＡ哺乳动物细胞表达体系。用人工合成的６个寡核苷酸连接成编码ＰＡⅠ－１Ｎ－端１０个氨基酸和２３个氨基酸的信号肽顺序；将构成的完整ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＳＶ２ｄｈｆｒ中，获得真核表达质粒ｐＺＹＳ－１；将ｐＭＡ２１２中的ｈＭＴ－ⅡＡ的起动子再插入ｐＺＹＳ－１，使ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ受ＳＶ４０和ｈＭＴ－ⅡＡ双启动子控制，得ｐＺＹＳ－２。２个表达质粒分别在ＣＯＳ－７细胞中进行表达。结果：获得两个真核表达质粒，在ＣＯＳ－７细胞中得到表达，在培养液中的ＰＡⅠ－１活性和抗原含量分别为２３４．７ＩＵ／ｍｌ和３０μｇ／Ｌ。结论：ｐＺＹＳ－１和ｐＺＹＳ－２两株ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ真核表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中能有效表达和分泌。

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。

人小分子尿激酶基因治疗的实验研究

探讨人小分子尿激酶（ｍＵＫ）基因治疗血栓性疾病的可行性；方法将ｍＵＫ与逆转录病毒载体ＬＮＳＸ重组构成ＬＮＳＸｍＵＫ，并转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，形成的重组逆转录病毒颗粒经背部皮下组织、腹腔及骨骼肌等途径注入小鼠体内，然后定期从尾部取血，发色底物法测定ｍＵＫ活性，并对注射部位切片进行免疫荧光组织化学染色；结果小鼠注射重组病毒后血中纤溶活性明显升高（Ｐ＜０．０１），免疫组织化学染色证实ｍＵＫ在注射局部细胞中获得表达。结论目前ｍＵＫ已持续表达４月余，显示了本研究技术路线在临床上具有较好的应用前景。

t－PA基因转移持续升高小鼠血浆纤维蛋白溶解活性

ｔ－ＰＡ基因转移持续升高小鼠血浆纤维蛋白溶解活性彭鲁英，崔宁，林冰，蔡旭，朱运松，宋后燕（上海医科大学基础医学院分子遗传学研究室２０００３２）血栓性疾病在心、脑血管疾病中占有重要比例，是这类疾病引起死亡的主要原因之一。而各种原因引起的纤溶系统功能降低...

人纤维蛋白降解产物D-双聚体和E片段的纯化和鉴定

D-双聚体和E片段均为交联型纤维蛋白的降解产物。根据它们的等电点的不同,建立了等电聚焦法纯化D-双聚体和E片段的方法。纯化的D-双聚体分子量约3.32×10^(-22)kg,含γ-γ双聚体片段(分子量1.36×10^(-22)kg)、β链片段(分子量7.30×10^(-23)kg)和α链片段(分子量2.49×10^(-23)kg)。Western Blot结果表明它可被抗D-双聚体单克隆抗体(McAb)识别。纯化的D-双聚体用ELISA检测,证实不含有E片段。纯化的E片段分子量约7.47×10^(-23)kg,还原后形成α链片段(分子量约1.03×10^(-23)kg)、β链片段(分子量6.14×10^(-24)kg)和γ链片段(分子量1.49×10^(-23)kg)3条肽链,可与抗E片段McAb进行免疫学反应。

人纤溶酶原激活剂抑制物2型在胃癌组织中的分布与表达

目的探讨人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因在胃癌组织中表达与分布的作用。方法采用ＡＢＣ方法检测发生和未发生淋巴结转移的胃癌组织中ＰＡＩ－２、ｕＰＡ和ＰＡＩ１的表达，各３０例。结果ＰＡＩ－２主要在平滑肌细胞中表达，ｕ－ＰＡ和ＰＡＩ－１主要在肿瘤细胞中表达（Ｐ＜０．０１）。ＰＡＩ－２在胃癌组织中的分布以及表达程度与肿瘤的淋巴结转移相关。肿瘤的淋巴结转移与肿瘤细胞是否表达ＰＡＩ－２无关（Ｐ＞０．０５）。但在有ＰＡＩ－２表达的病例中，肿瘤的淋巴结转移却与肿瘤细胞ＰＡＩ－２的表达程度呈正相关，而与平滑肌细胞ＰＡＩ－２的表达程度呈负相关（Ｐ＜０．０１）。

PAI-2ΔCD突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体基因，实现在大肠杆菌中的表达并建立重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ的分离纯化方法。方法用ＰＣＲ扩增ＰＡＩ－２ΔＣＤ基因，经限制性内切酶片段分析及核苷酸序列分析后，突变体基因与原核表达载体ｐＬＹ－４重组并转化蛋白酶缺陷型菌株ＪＦ１１２５。经温度诱导表达，表达产物用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法和纤溶抑制活性测定等方法鉴定。工程菌发酵后，经高压匀浆破菌，用离子交换、疏水性色谱和分子筛进行分离。结果经温度诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实在相应相对分子质量处出现表达条带，约占全菌总蛋白的１５％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法证实表达产物具有ＰＡＩ－２免疫原性，溶圈抑制法及翻转板法证实表达产物具有纤溶抑制活性。５Ｌ发酵菌液可得湿菌约１００ｇ，经多步纯化后，每升发酵菌液可得纯度达９７％的ＰＡＩ－２ΔＣＤ约３６ｍｇ，比活性为２８６４０ＡＩＵ／ｍｇ。结论成功构建了ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体，实现了在大肠杆菌中的表达，并成功地分离纯化了重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ蛋白。

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建

构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ、ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲ、ｐＭＡＲＨ质粒，并用限制性核酸内切酶鉴定、核酸序列分析证实。结果琼脂糖凝胶电泳显示了特异的片段，序列分析证实获得的ｐＭＡＨＲ为Ａｓｎ１１７和Ａｓｎ１８４位点突变的阳性克隆，ｐＭＡＲＨ为Ａｓｎ４４８位点突变的阳性克隆。结论成功地构建了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ糖基化位点突变体。

抗人IgG单克隆抗体制备和鉴定

以人ＩｇＧ为抗原，采用杂交瘤技术获得６株不同性质的抗人ＩｇＧ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）（ＡＩ２、ＡＩ３、ＡＩ４、ＡＩ５、ＡＩ６、和ＡＩ）。ＡＩ２ＭｃＡｂ具有抗ＩｇＧ１亚类的特异性，可识别ＩｇＧγ链和Ｆ（ａｂ＇）２片段，作用位点可能在人ＩｇＧ１铰链区。ＡＩ３ＡＩ、ＭｃＡｂ分别为ＩｇＧ３、ＩｇＧ４亚类限制性ＭｃＡｂ，可能作用于ＩｇＧＣＨ１区。ＡＩ４ＭｃＡｂ可识别χ和λ型ＩｇＧ四个亚类以及Ｆ（ａｂ＇）２片段，不识别游离χ、λ链。ＡＩ５ＭｃＡｂ特异地抗ＩｇＧ１结合型χ，作用于ＩｇＧ独特型位点。ＡＩ６ＭｃＡｂ只抗λ型ＩｇＧ，可能作用于ＩｇＧＣＬ区。６种抗人ＩｇＧＭｃＡｂ除了ＡＩ５外，均能用于人血清中ＩｇＧ的检测。