目的:构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响。方法:提取人VSMC总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿...目的:构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响。方法:提取人VSMC总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC,采用W estern b lot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,经DNA测序,确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论:已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。展开更多
文摘目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的c-Jun基因表达,探讨其表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法设对照组(VSMCs不作处理)、阴性si RNA组(VSMCs转染无关序列的si RNA)及c-Jun si RNA组(VSMCs转染c-Jun si RNA)。应用RT-PCR半定量法检测VSMCs中c-Jun的mRNA水平,Western blot法检测VSMCs中c-Jun的蛋白水平,应用MTT比色法及3H-TdR掺入法检测VSMCs的增殖情况,流式细胞仪检测VSMCs的细胞周期变化。结果c-Jun si RNA组的c-Jun mRNA及蛋白表达水平均较对照组明显降低(P<0.05,P<0.01),而阴性si RNA组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。c-Jun si RNA组VSMCs的增殖活性较对照组明显降低(P<0.05),细胞周期出现明显的G0/G1期阻滞;而阴性si RNA组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论RNA干扰介导的c-Jun基因沉默可显著抑制VSMCs的体外增殖。
文摘目的:构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响。方法:提取人VSMC总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC,采用W estern b lot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,经DNA测序,确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论:已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。