土壤矿物与微生物相互作用的机理及其环境效应

土壤矿物与微生物相互作用是地球表层系统中重要的生态过程。微生物或生物分子与矿物间的吸附(粘附)是两者相互作用的基础。吸附(粘附)是一个由分子间力、静电力、疏水作用力、氢键和空间位阻效应等多种作用力或作用因素共同决定、影响的物理化学过程。因此,微生物和矿物的表面性质如表面电荷、疏水性和它们所处的环境条件如pH、电解质浓度、温度等,都影响着矿物-微生物吸附(粘附)过程。微生物细胞或酶可吸附于矿物表面,其结果是细胞代谢或酶活性会发生明显变化,并进一步影响土壤中诸多相关的生态、环境过程。结合4种典型的初始吸附理论:表面自由能热力学理论、DLVO理论、吸附等温线理论和表面复合物理论及本课题组近年来的研究成果,对土壤矿物与微生物相互作用的类型、机理、作用力和现代研究技术等方面的最新研究进展进行了较为全面的论述,对土壤矿物-微生物相互作用的环境效应进行了讨论,并就该领域今后研究工作的特点及应关注的问题进行了展望。

副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失株的部分生物学特性

副猪嗜血杆菌(HPS)是引起猪格拉瑟病(Glasser’s disease)的病原菌,给全球和中国规模化养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中血清7型是近年来分离比例越来越高的血清型,也是危害越来越严重的血清型。crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中对细菌适应环境变化起着至关重要的作用。为了筛选副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失弱毒株,采用自然转化法构建了副猪嗜血杆菌血清7型临床分离株HPS7的crp基因缺失株,对HPS7及其crp基因缺失株的生长特性、生物膜形成、抗药性、毒力等进行了研究。结果表明,HPS7的crp基因缺失后,生长显著减慢,自凝速度减慢,生物膜形成能力明显减弱,对大部分抗生素的抗性降低,对豚鼠的毒力降低。以上结果说明crp基因对HPS7的生长、抗药性、毒力均有明显影响。本研究结果为筛选副猪嗜血杆菌血清7型弱毒株提供了参考。

巴氏杀菌水牛奶在不同储存条件下微生物增长规律的研究

摘要：为了评估巴氏杀菌水牛奶在不同储存温度下的最佳储存时间及杀菌效果，对巴氏杀菌水牛奶在不同温度环境下储存不同时间段的微生物菌落总数及金黄色葡萄球菌菌落数的变化规律进行研究。结果表明，巴氏杀菌水牛奶在4℃环境中的最佳储存时间为0—60h，在10℃环境中的最佳储存时间为0～48h，而在20℃、30℃环境中分别只能储存20h和8h。在3天的储存期内，30℃环境中储存的巴氏杀菌水牛奶中微生物增长速度最快，在4℃环境中储存时微生物增长速度最慢，储存效果最好。同时经巴氏杀菌的水牛奶中均未检测出金黄色葡萄球菌。

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66 株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型Pm,1株为B型Pm,1株无法定型;有8株用PCR检测为T+ Pm;豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8 株T+ Pm都为D型,都分离于有严重PAR症状的猪。

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定,药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中,不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9%)、副猪嗜血杆菌(50.0%)、大肠杆菌(43.1%)、巴氏杆菌(25.5%)、绿脓杆菌(17.6%)和沙门氏菌(11.8%)。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb,而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明:各菌株对15种药物的耐药谱不同,但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。

猪链球菌2型溶血素基因缺失菌株的构建及生物学特性的研究

溶血素(SLY)在猪链球菌2型(SS2)侵入和裂解细胞的过程中发挥重要作用,被认为是SS2的一种重要的毒力相关因子。为了探讨SLY在2005年中国四川资阳分离强毒株SS205ZY致病过程中的作用,作者利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的sly基因敲除突变菌株(Δsly)。并比较了菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力。结果表明sly基因敲除后可导致猪链球菌裂解红细胞的能力显著下降,对小鼠的致病力也有一定程度的减弱,但仍表现较高的致病力。本研究结果提示SLY是猪链球菌裂解细胞的重要毒力相关因子,但造成SS205ZY的高致病性很显然与多种毒力相关因子的协同作用有关。

犬细小病毒的分离鉴定与生物学特性分析

本研究旨在获得华中地区的犬细小病毒分离株并对其基因型分型、生物学特性及致病力进行探讨。从武汉部分宠物医院采集胶体金初检阳性的14份可疑病料,用猫肾细胞(F81)进行病毒分离。根据犬细小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,先后设计2对引物,进行PCR扩增。在细胞上对其进行空斑纯化,进行一步法生长曲线测定,并进行电镜观察。最后对这5株病毒都进行动物回归试验。细胞传代结果表明得到5株细小病毒。PCR扩增结果表明获得390和583bp 2个片段。将2个片段测序的结果与GenBank发布的CPV-2比对,表明所获得的5株病毒中,有4株属于2a型,1株属于2b型。空斑纯化及生长曲线绘制结果表明分离毒株增殖滴度可达105.5 PFU.mL-1。电镜观察结果表明,感染细胞的线粒体肿胀。动物试验结果表明犬都能表现不同程度的发病状况,大体解剖发现肠管有坏死、心肌变薄。将病变的心脏制作切片观察,结果表明心肌细胞变性、坏死。本研究结果为进一步研究CPV-2的分子生物学和分子致病机理奠定了基础。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌flic基因的原核表达与生物学活性分析

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型菌株基因组为模板,根据其鞭毛区与其它细菌高度同源性设计引物,利用PCR方法扩增鞭毛蛋白基因flic片段,将其亚克隆到pMD-18T载体中并进行PCR和酶切鉴定,再将其亚克隆与载体pGEX-kG分别双酶切和连接,构建重组表达载体pGEX-flic,并将其转化大肠杆菌工程菌BL21进行原核表达。结果表明,目的基因片段长度为528bp,在大肠杆菌BL21中获得成功表达,且表达蛋白能与猪抗APP血清发生反应。为进一步研究细菌鞭毛的抗原性及其他功能提供参考。

猪源艰难梭菌的分离鉴定与生物学特性分析

为了了解我国猪源艰难梭菌(Clostridioides difficile,CD)的病原学及分子生物学特征,本研究收集湖北和广东地区疑似患有肠炎的病猪粪便样品,提取基因组DNA,利用已经报道的5重PCR方法对艰难梭菌的16S rDNA基因、毒素A的编码基因tcdA、毒素B的编码基因tcdB以及二元毒素编码基因cdtA和cdtB进行检测,同时采用厌氧培养法,对PCR检测毒素编码基因为阳性的粪便样品进行艰难梭菌的分离培养,并对所分离到的菌株进行药物敏感性测试和全基因组重测序。结果发现:本研究所采集到的97份粪便样品经PCR检测显示有80份样品为16S rDNA阳性,其中仅有2份样品为tcdA和tcdB阳性。从这两份样品中分离出一株tcdA和tcdB阳性的艰难梭菌,命名为HuB01。药敏试验发现,HuB01对头孢菌素(FOX)、氯霉素(CHL)、克林霉素(CLI)、氨苄西林(AMP)、头孢曲松钠(CRO)耐药,对莫西沙星(MXF)和万古霉素(VAN)表现出中度耐药,而对利福西明(RFX)、甲硝哒唑(MTZ)、非达霉素(FDX)敏感。全基因组重测序发现HuB01的全基因组大小为3.93 Mb,平均GC含量为28.31%,编码3691个蛋白基因及63个tRNA和10个rRNA;3691个基因中含有31个耐药基因和164个毒力相关基因。多序列位点分型(MLST)结果显示HuB01为ST11。由于目前国内对于艰难梭菌的研究大多集中在人医领域,因此本研究可为兽医领域艰难梭菌的相关研究奠定基础。

不同猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合体液免疫效果评估

为了比较不同猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对体液免疫效果的影响,本试验选择新引进猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性后备母猪的3个猪场,将各场内猪只按体重分为3个阶段:7~20、20~35和35~50 kg,各场分别从中选取20头猪,共180头猪。每场选用1种免疫方案,第1组混合疫苗组,为首次免疫PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),28 d后加强免疫PRRS灭活疫苗(CH-1a株);第2组弱毒疫苗组,为2次均免疫PRRS弱毒疫苗;第3组灭活疫苗组,为2次均免疫PRRS灭活疫苗。疫苗首次免疫后14、28、42和56 d采集猪血清,进行特异性PRRSV ELISA(N蛋白)检测和中和抗体评价;首次免疫后14和28 d采集猪血液,进行PRRSV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血液内是否存在PRRSV;统计试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数,进行临床数据比较分析。结果显示,35~50 kg体重阶段猪只接种疫苗后ELISA检测抗体水平增高较其他2个阶段更明显。混合疫苗组在免疫56 d时血清ELISA阳性率为100%,且ELISA结果极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01)。尽管各组没有产生特异性抗NADC30-like毒株的中和抗体,但针对PRRSV经典和高致病性毒株的中和抗体保护效价结果显示,混合疫苗组在免疫56 d时中和抗体效价极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01);RT-qPCR检测未发现阳性猪;各组试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,混合疫苗组对体液免疫的促进效果显著优于弱毒疫苗组和灭活疫苗组。该试验为临床正确选择PRRS疫苗免疫方案提供了科学数据。

猪弓形虫病阻断ELISA方法的建立及初步应用

本研究利用制备的GRA7单克隆抗体为基础建立猪弓形虫病的阻断ELISA方法。以rGRA7重组蛋白免疫小鼠,取脾细胞进行细胞融合,筛选出4株能够稳定产生单克隆抗体的阳性单克隆细胞株。经对此单克隆抗体进行IFA和Western blot检测确认成功制备GRA7蛋白的单克隆抗体后,以重组蛋白为包被抗原对阻断ELISA方法进行优化后,经过重复性、交叉性、符合性实验验证本方法具有可重复性,与MAT符合性高。初步应用于288份临床样品检测,检出率为11.46%,与MAT检测结果重合率为84.8%。本研究成功制备弓形虫GRA7蛋白的单克隆抗体,并建立了一种猪弓形虫病的阻断ELISA方法,为弓形虫病的检测提出了新的方案。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌flic基因的克隆表达及生物信息学分析

【目的】构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae,App)鞭毛蛋白(flic)编码基因的重组表达质粒,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并将其在原核细胞中进行表达。【方法】利用PCR方法扩增flic基因片段,将其克隆至pMD-18T载体后测序,利用生物信息学软件对其编码蛋白的二级结构及跨膜区进行预测。构建重组表达质粒pGEX-flic,转化大肠杆菌工程菌BL21,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE及Western-blo对表达蛋白进行鉴定。【结果】获得的目的基因片段长度为528 bp,测序表明其序列与GenBank公布的一致;软件预测结果显示,该蛋白具有多个明显的二级结构成分及跨膜区;SDS-PAGE检测表明,在约50 ku处有一特异性条带;Western-blot检测表明,表达蛋白具有良好的抗原活性。【结论】成功获得了App的flic基因,其编码的蛋白质具有较多的α螺旋区和无规则卷曲区域,表达的鞭毛蛋白具有生物学活性。

猪肝羧酸酯酶研究进展

羧酸酯酶(carboxylesterases,CES,E.C.3.1.1.1)属于丝氨酸水解酶类,该酯酶在哺乳动物各种器官和组织中存在,在肝脏组织和小肠组织中含量丰富,可催化水解多种内外源性物质,发挥重要的药理学和生理学作用。20世纪初就有猪肝羧酸酯酶的研究报道,但大部分研究是围绕其在有机化学合成中的应用,而对该酶的生理功能研究较少。猪肝羧酸酯酶家族成员数量多,水解特性互补,在重要组织器官内以高丰度存在,该酶家族在维持机体内环境稳态中发挥着重要的作用。有关猪肝羧酸酯酶基因家族及生理、药理、免疫等功能的报道很多,论文对猪肝羧酸酯酶的基因与同工酶、空间结构、催化水解特性及功能进行系统综述,以期为相关研究提供参考。

附属基因调节子在葡萄球菌生物被膜形成与感染中的作用

葡萄球菌生物被膜是生物材料相关感染病理学中最重要的毒力因子,生物被膜形成是由群集感应系统调节的。葡萄球菌附属基因调节子agr作为群集感应系统具有种属特异性,在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中控制着一系列毒素和毒力因子的表达,而且与天然免疫系统互作。新的研究进展表明附属基因调节子agr在体内感染中的作用非常微妙。这方面的进展有助于发掘新型抗菌剂和消除与装置相关的葡萄球菌生物被膜感染问题。

华中地区鸡源沙门菌分离鉴定及耐药性分析

为了探明华中地区种鸡场沙门菌(Salmonella)的优势血清型和耐药情况,本研究从湖北、河南、湖南等省市22个规模化鸡场采集病鸡、死胚及弱雏组织样品3 724份,通过分离培养、生化试验、PCR鉴定及血清型试验确定分离菌种属及其血清型,并采用Kirby-Bauer法对分离菌株进行了耐药性分析。结果显示,本试验从3 724份病料中共分离鉴定出124株沙门菌,其中79株为D群肠炎沙门菌(63.71%,79/124),34株为D群鸡白痢沙门菌(27.42%,34/124),8株为B群鼠伤寒沙门菌(6.45%,8/124),有3株沙门菌未能确定血清型。O抗原鉴定79株肠炎沙门菌和34株鸡白痢沙门菌为O9,8株鼠伤寒沙门菌为O4。H抗原鉴定79株肠炎沙门菌为Hg,m,8株鼠伤寒沙门菌为Hi。药敏试验结果显示,124株分离菌株对萘啶酸、氨苄青霉素、四环素和多西环素耐药率分别为95.97%(119/124)、91.94%(114/124)、57.26%(71/124)和70.16%(87/124);对复方新诺明和红霉素耐药率分别为25.81%(32/124)和12.10%(15/124);对氯霉素、庆大霉素、头孢噻肟和卡那霉素耐药率分别为6.45%(8/124)、1.61%(2/124)、1.61%(2/124)和0.81%(1/124);对左氧氟沙星、阿米卡星和多黏菌素B完全敏感。99.19%(123/124)的分离株至少对一种药物耐药,87.10%(108/124)的分离株表现多重耐药。本研究为华中地区养鸡场沙门菌的诊断及防控提供了数据支撑。

河南省和湖北省部分地区鸡球虫分离株对磺胺氯吡嗪钠耐药性调查

为了解河南省和湖北省鸡球虫对磺胺氯吡嗪钠的耐药现状,选取河南省18个地区和湖北省17个地区的地方分离株进行鸡体笼养试验,以抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI)来评价各虫株耐药性。研究结果显示,在所研究的93株鸡球虫分离株中,河南省共计虫株52株,湖北省共计虫株41株。在河南省52株分离虫株中,有25株对磺胺氯吡嗪钠完全耐药(ACI<160),16株中度耐药(160≤ACI≤180),11株敏感(ACI>180);在湖北省共计41株鸡球虫分离虫株中,有9株完全耐药,9株中度耐药,23株敏感。研究结果为河南省和湖北省鸡球虫的耐药性提供了数据支撑。

用于单细胞转录组测序的紫花苜蓿根和叶原生质体提取方法研究

以紫花苜蓿种子为材料,研究了不同的酶解液浓度、渗透压、离心力对叶和根原生质体分离的影响,旨在获得高产量、高活性的原生质体悬浮液,以便能够使用10×Genomics平台进行单细胞转录组测序,进而了解植物细胞分化的轨迹。结果表明:适用于根的最佳酶解液浓度、甘露醇浓度、离心力分别为2%纤维素酶+1%离析酶、0.5 mol/L、300 g;适用于叶的最佳酶解液浓度、甘露醇浓度和离心力分别为1.25%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶、0.4 mol/L、180 g。在此条件下,根原生质体的产量和活性分别达到3.95×10^(6)个/g和81%,叶原生质体的产量和活性分别达到7.09×10^(6)个/g和71%,达到10×Genomics平台的上机标准,为进一步开展紫花苜蓿发育的分子细胞生物学研究奠定基础。

2020—2022年湖北省生猪屠宰场伪狂犬病病毒的分离鉴定及遗传进化分析

旨在监测湖北省生猪屠宰场中伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的流行情况。采集2020—2022年湖北省4个区域(鄂东、鄂北、鄂西、鄂中)共9个县市不同规模屠宰场的1795份血液样品和2081份肺样品(肺、肺门淋巴结),分别使用靶向PRV gE基因的ELISA和PCR方法检测血清中的抗体和肺样品中的病原,同时对阳性样品进行病原分离鉴定、全基因组测序和遗传进化分析。血清学检测结果显示,共有104份样品为阳性,平均阳性检出率为5.79%。病原学检测结果显示,共有82份样品为阳性,平均阳性检出率为3.94%。按不同因素对检出率进行分析,显示抗体和病原都在春季检出率最高,分别为18.57%和9.74%;湖北省东部的抗体检出率最高(10.77%),中部的病原检出率最高(4.93%);A类小型屠宰场的病原和抗体检出率都显著高于其他3个类型,分别为16.28%和6.01%。从病原阳性样品中共分离到PRV 17株,经全基因组和gB、gC、gE基因遗传进化分析结果显示均属于基因Ⅱ型变异株,与Bartha、NIA-3、Becker等早期国外分离株处于不同的遗传进化分支。其中HBXG疑似发生了基因Ⅰ型毒株与基因Ⅱ型毒株的重组,与早期报道的重组病毒HuB1/CHN2017同处于独立的clade2.2遗传分支。综上所述,湖北省屠宰场关联的猪场中主要流行PRV变异毒株,且免疫过疫苗的猪场还在发生疫苗株与野毒的重组与变异,因此本研究对PRV的持续监测与新型疫苗的研发工作有十分重要的意义。

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学(IHC)检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示:通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生反应,特异性良好。本研究制备的PDCo V N蛋白单克隆抗体可为PDCo V诊断方法的建立以及N蛋白的功能研究奠定基础。

猪δ冠状病毒辅助蛋白研究进展

猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪的腹泻、呕吐、脱水、死亡,而且具有跨种感染潜能,给养猪业和公共卫生构成了巨大威胁。冠状病毒的辅助蛋白(accessory protein)是一类功能特殊的蛋白,不同属甚至同属不同种的冠状病毒编码的辅助蛋白数量、同源性均存在较大差异,具有属或种特异性。虽然辅助蛋白是冠状病毒增殖非必需的,但在调控宿主天然免疫、病毒复制与致病性中发挥重要作用。目前,已证实PDCoV至少编码3个辅助蛋白,而且近年来在PDCoV辅助蛋白的功能研究方面取得了显著进展。本文简要介绍了PDCoV辅助蛋白的鉴定及其在免疫调控和致病性中的作用,并对今后的研究进行了展望。