医学微生物学教学实验室的生物安全思考

生物安全是是医学微生物学实验教学的重要方面。医学微生物学实验室应从标本的发放、实验操作、结果观察、废弃物的处置等方面加强生物安全教育和监管。

针对口腔医学专业的医学微生物学实验教学改革尝试

为了将华西医学基础实验教学中心提出的"以学生为中心、以质量为核心、以能力为导向"的实验教学理念更好融合到医学实践教学环节中,我们针对口腔医学的专业特点对医学微生物学实验课进行了大胆改革。在改革后的课程中设置了名为"认识你所不知道的自己"的全新教学单元,让学生在生动的自我探索过程中,全面了解口腔微生物的特点及其与口腔常见疾病的关系,掌握口腔微生物学研究的常用技术手段、科研思路,也培养了同学们良好的团队合作意识。医学微生物实验课个性化、专业化的巧妙课程设计,大大提高了学生们的学习兴趣,也收获了更加优秀的教学成效。

不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白的表达及其生物学活性分析

目的在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的重要粘附因子Hap蛋白,并对其免疫原性和粘附活性进行初步研究。方法 IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Hap在E.coliBL21中高效表达,Ni2+亲和层析柱纯化表达产物。用纯化的Hap重组蛋白进行体外竞争黏附实验,SEM观察及菌落形成单位计数法分析该重组蛋白的黏附活性。纯化蛋白与黏膜免疫佐剂CT-B联合鼻腔免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠抗Hap的IgA及IgG抗体水平。结果纯化产物的SDS-PAGE分析显示获得单一的目的蛋白条带,Gelanalysis软件分析蛋白纯度可达85%,纯化产物超滤浓缩后,测得其蛋白浓度为3.2g/L。体外竞争黏附实验观察到Hap重组蛋白的加入可明显抑制NTHi对胞外基质的黏附,且细菌黏附量的减少与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。该重组蛋白与免疫佐剂CT-B联合免疫小鼠,可刺激机体产生较高水平的IgG或IgA抗体,与重组抗原单独免疫组相比,差异具有显著性(P<0.05)。结论 Hap蛋白在原核系统中获得较高浓度和纯度的表达,纯化Hap重组蛋白具有良好的免疫原性和粘附活性。

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带。杂交瘤细胞培养上清效价为1∶640,腹水效价为1∶25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106L/mol。结论成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础。

中国口腔医学各专业实习生对乙型肝炎病毒感染知、信、行情况调查

目的调查及比较中国口腔医学不同专业实习生对于乙型肝炎病毒(HBV)感染的知识、态度、行为(KAB)。方法对232名进入临床实习阶段的口腔实习生进行问卷调查,采用数据描述及双变量分析的方法得出KAB与不同专业及性别之间的关系。结果在各专业口腔实习生中,超过80%的调查对象具有"较高"或者"高"的知识等级,其中修复科实习生的知识得分高于口腔内科(P=0.035)和口腔外科(P=0.01987)。口腔内科实习生的态度与是否接触HBV感染患者有关(P=0.006),口腔外科亦然(P=0.047)。超过60%的实习生接受过至少3次的乙肝疫苗接种,特别是正畸科实习生(约80%);34%的口腔内科实习生表示"总是"或者"经常"检查抗体滴度,但66%的正畸科实习生表示"很少"或者"从不";正畸科实习生比口腔内科的针头扎伤率低(P=0.044),与口腔外科相比,有相对较低的趋势(P=0.053);100%的正畸科实习生"总是"使用工作服。此外,口腔内科实习生相比于口腔外科(P=2.31e^(-6)),修复科(P=1.704e^(-7))及正畸科(P=1.3e^(-5))实习生来说,行为得分更高,女性学生的行为得分显著高于男性学生(P=2.584e^(-5))。结论修复科实习生应掌握更多关于HBV传播的知识,正畸科实习生应提升疫苗注射率及检查抗体滴度,口腔内科实习生应更注重理论与实践结合,口腔外科实习生可提升自我效能及保持积极态度。

抗人SOCS1单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的制备高效价的抗人SOCS1单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以重组GST-SOCS1融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot显示在相对分子量为6.0×104处出现特异性反应带。杂交瘤细胞培养上清效价为1∶1280,腹水效价为1∶102400,Ig亚类为IgG1,相对亲和力达1.17×107L/mol。结论成功制备出能特异性识别人SOCS1的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS1在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础。

病原生物学综合性实验的设计与实施

围绕临床病例,以开设病原生物学综合性实验为载体,进行基础医学实验教学改革,着力培养学生的创新精神和实践能力,探索提高教学质量、培养高素质医学人才的途径,构建"探究为基础"的医学实验教学模式。

虚拟仿真实验在病原生物学实验中应用设想

在病原生物学实验开展虚拟仿真实验,主要包含实验室设置的虚拟仿真和实验内容的虚拟仿真。实验室设置的虚拟仿真实验可拓展对病原生物学实验中生物安全教育方面的内容,病原生物学实验操作的虚拟仿真不仅可以作为传统实验教学的补充,还有利于对学生综合能力的测试。虚拟仿真实验效果的评价可从教学效果和实验效果方面进行。

多视角录播模式在病原生物学实验教学中的应用设想

为推进病原生物学实验教学改革,设想建立以多视角录播模式为基础的病原生物学实验教学体系,包括病原生物学实验教学多视角录播系统和病原生物学实验操作数字化评估系统。希望通过人机交互的实验教学、操作和评估方式,在提高学生学习积极性的同时,更有效地培养学生的观察能力、思维能力和实验操作能力。

开设研究性实验,培养医学生的创新意识

以临床病案为中心,开设研究性实验,是我院《医学微生物学》课程教学改革的一项重要内容。实践证明,研究性实验提高了学生的学习积极性,使学生掌握了文献查阅方法,具有了熟练的操作技能?严谨的实验作风和良好的研究素质,促进了学生的独立思考能力,增强了大学生的创新意识。

重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究

目的构建含有幽门螺杆菌尿素酶(ureI、ureB)及霍乱毒素B亚单位(ctB)融合片段的多表位疫苗工程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基因中筛选出T细胞和B细胞优势表位,通过柔性Linker相连,并在其N端加入分子内佐剂序列ctB,按照大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,即为BIB序列。人工合成之后,插入原核表达质粒pET28a(+)中,构建pET28a(+)/ctB-ureI-ureB〔pET28a(+)/BIB〕重组质粒。经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定正确后,将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。BIB工程菌经乳糖诱导表达后,SDS-PAGE检测重组蛋白BIB的表达情况,并对其N端氨基酸序列和相对分子质量进行测定,Western blot对其进行抗原性鉴定。结果原核表达质粒pET28a(+)/BIB经双酶切和测序鉴定构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量33×103处有一条明显条带,其N端氨基酸序列和相对分子质量与设计序列100%一致,Western blot结果显示BIB可以与抗幽门螺杆菌悉尼株(SS1株)小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。结论成功构建了幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌,该工程菌表达的BIB蛋白抗原性良好。

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究(英文)

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的研究携带类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态类整合酶基因(intI1)mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制。方法采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平。首先用PCR方法从类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA(cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA(cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1mRNA的表达量。结果两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍)。结论铜绿假单胞菌在生物被膜状态下类整合子intI1mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一。

荧光定量PCR法检测不同状态下铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达

目的检测铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因(intⅠ1基因)在生物膜状态和浮游状态表达水平的差异,探讨整合子的作用机制。方法对3株Ⅰ类整合酶阳性的铜绿假单胞菌分别进行液相培养和生物膜细菌培养,常规方法提取3株细菌两种生长状态的总RNA。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法,以细菌的16srRNA为内参照,分别测定菌株SW07、R07和TH12的浮游细菌和生物膜细菌intⅠ1mRNA的相对表达量,比较3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达水平。结果3株铜绿假单菌的生物膜细菌和浮游细菌都检测到intⅠ1基因的表达。3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达量不同,生物膜细菌intⅠ1基因的表达水平较高,其中菌株R07、SW07和TH12的生物膜细菌intⅠ1mRNA的表达量分别较浮游细菌高1.4、5.7和128倍。结论在生物膜状态下,铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达上调,本实验结果提示整合子在生物膜细菌中可进行更加活跃的基因盒捕获和积累,整合子和细菌生物膜的形成是导致细菌对抗生素耐药的重要机制。

鸭GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立鸭GAPDH基因的real-time PCR技术,为鸭功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础.根据GenBank中鸭GAPDH基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的real-time PCR方法.结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点.研究结果为鸭GAPDH作为内参基因用于鸭相关基因定量表达分析奠定了基础.

溶原性噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的研究铜绿假单胞菌(PA3094)溶原性噬菌体Ppa3094对该菌生物被膜形成的影响。方法采用平板培养法建立PA3094及PA3094-L(带前噬菌体Ppa3094的溶原性菌株)两株菌的体外生物被膜模型;MTT法测定生物被膜形成过程中两株菌的生物被膜活菌量;实时荧光定量PCR测定两株菌在培养不同时间点藻酸盐合成基因algC、algD的表达量。结果两株菌均在培养5～7 d时形成成熟的生物被膜,呈薄膜状。在生物被膜形成过程中,两株菌的生物被膜菌量存在明显差异,在整个生物被膜形成过程中,PA3094生物被膜菌量均比PA3094-L高;PA3094-L在培养第5 d时生物被膜菌量达最高,第7 d有所下降。随着培养时间的延长,藻酸盐合成基因algD、algC表达量均上调,但PA3094-L表达量均比PA3094低,且algC表达量差异更大。结论铜绿假单胞菌溶原性噬菌体Ppa3094可降低藻酸盐合成基因algD、algC的表达,从而影响生物被膜的形成。

可生物降解材料作为基因载体的研究

研究可生物降解聚合物作为控制释放的基因载体。合成聚乳酸-聚乙二醇二元共聚物（Poly（Dl-lactic acid）-co—poly（ethylene glycol，PELA）及聚乳酸-聚乙二醇-聚乙醇酸三元无规共聚物（Poly（lactic acid）-co—poly（ethylene glycol）-co—poly（glycolic acid）random copolymer，PLGAE），包裹质粒pCH110。探讨了PELA和PLGAE作为基因载体包裹DNA的各种影响因素，这两种控制释放体系的体外降解及释放行为以及对它们的细胞毒性及体外转染效率进行了测定。制备的PELA微球平均粒径1～3μm，包裹效率为62％。PLGAE微球平均粒径0．72μm，包裹效率为70％。采用包裹了质粒pCH110的微球对COS-1细胞的细胞毒性及转染实验中得出：二者的细胞毒性较小，PELA和PLGAE的转染效率均较高，且能持续表达96h，其中PLGAE的缓释效果更明显。可生物降解聚合物材料作为基因载体具有较强的优越性。

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立检测鸭疱疹病毒1型（鸭瘟病毒）的实时荧光定量PCR方法，为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法 根据病毒DNA聚合酶基因的序列，设计引物和探针，采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR，用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照，构建标准曲线，对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价，同时与传统PCR方法进行比较研究。结果 标准曲线表明在2．3×10^5～2．3×10拷贝数之间有很好的线性关系（r=0．999）；实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒，说明有很好的敏感性；试验内及试验间变异系数分别为1．22～6．69以及2．09～8．84，说明有较好的重复性；对非鸭瘟病毒DNA无扩增，说明有很好的特异性；在对病毒DNA的检测方面，比传统PCR的敏感性高出10^4倍。结论 成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。

2种纯化流感病毒方法的比较研究

目的比较2种纯化浓缩鸡胚尿囊液中流感病毒方法。方法将流感病毒鸡胚尿囊液分别采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient centrifugation,SDGC)和红细胞吸附释放法(absorptionandrelease RBC,AR RBC)进行纯化,收集纯化病毒测定血凝效价,比较2种纯化方法。结果SDGC法纯化病毒可在30%和45%蔗糖层面交界处的区带中检测到流感病毒,血凝效价为1∶2560;用AR RBC法纯化病毒过程中用新鲜鸡红细胞出现了溶血现象,而用甲醛处理过的鸡红细胞则无此现象,血凝效价均为1∶2560。结论与SDGC法纯化病毒比较,AR RBC法是一种经济实用、操作简便并有较高纯化效率的方法,尤以甲醛处理过的鸡红细胞纯化效果最好。