四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制 ,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度 (MIC) ,再通过聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株 gyr A耐药决定区 (QRDR)突变 ,并和标准株 H 37Rv比较。结果 6 8株临床分离株中 ,14株喹诺酮药物敏感株和 8株低耐药株未发现 gyr A耐药决定区基因突变 ,2 5株高耐药株、11株低耐药株和 10株药物敏感株检测到 gyr A基因突变 ,高耐药株突变率为 10 0 % ,低耐药株突变率为 5 8% ,敏感株突变率为 4 2 % ,总的突变率为 6 8%。根据 SSCP条带 ,gyr A突变可分成 4种类型 ,测序发现分别为 Ser95 Thr、Asp94 Gly、Ala90 Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyr A基因突变密切相关 ,gyr A基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。

结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免—BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察。方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS阴性对照组,DNA初免—BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次。PBS组3次均注射PBS溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫。末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平。结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1∶120、1∶160、1∶80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05)。结论:联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

IL-12联合结核杆菌DNA疫苗初免-BCG加强免疫的免疫效果观察

目的研究并比较IL-12联合结核分枝杆菌(TB)DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗初免-BCG加强免疫的应答效果。方法将小鼠随机分成PBS阴性对照组和4组免疫组:BCG组、DNA(Ag85A和ESAT-6)初免-BCG异源加强组、DNA+IL-12初免-BCG异源加强组和DNA初免-BCG+IL-12异源加强组。末次免疫后4、6、8周分别测定血清总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验(流式细胞仪检测),测定脾细胞培养上清中IFN-γ分泌水平,并检测小鼠脾脏淋巴细胞表型。结果4组免疫组体外经TB纯蛋白衍生物(TB-PPD)刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,且抗体水平在末次免疫后4～8周逐渐增加,4组平均效价为1∶80,1∶120、1∶160、1∶160,各组抗体水平增加无明显差异(P>0.05);小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,4组免疫组均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平均明显强于BCG,DNA/BCG组(P<0.05),但DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组间差异不明显;4组免疫组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞较PBS组有较大升高(P<0.05),且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比大于BCG以及DNA/BCG组(P<0.05)。结论IL-12联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略较BCG免疫以及单纯的DNA疫苗初免-BCG加强免疫能在小鼠体内诱导更强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究

目的 构建人抗菌肽 FAL L - 3 9定点突变子及研究其抗菌活性。方法 采用 PCR体外定点突变技术( PCR- SDM) ,设计两对引物 ,引入一个突变点 ,通过重叠延伸法两次 PCR扩增 ,使 FAL L - 3 9第 3 2位密码子由AAT突变为 AAG,将扩增片段克隆入 PGEXλ1T质粒中 ,转化大肠杆菌 JM10 9,并用 IPTG诱导 ,表达的 FAL L -3 9- lys3 2经纯化后与 FAL L - 3 9进行抗菌活性比较。结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后的FAL L - 3 9- lys3 2蛋白对大肠杆菌 ML - 3 5 p的抗菌活性明显增强 ,其最低抑菌浓度 ( MIC)和最低杀菌浓度 ( MBC)分别由 FAL L - 3 9蛋白的 18.75和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 10 .94和 2 1.88μg/ m l,对绿脓杆菌ATCC2 785 3的 MIC和 MBC值分别为 FAL L - 3 9蛋白的 3 1.2 5和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 18.75和 3 1.2 5μg/ ml。两种蛋白均在含 Medium E的 L B培养基中表现出较高活性 ,在 L B培养基中抗菌活性最低 ,但在同一种培养基中 FAL L - 3 9- L ys- 3 2蛋白抗菌活性要高于 FAL L - 3 9蛋白。结论 用两步 PCR定点突变技术获得一个 FAL L - 3 9- L ys3 2突变子 ,其表达分子的抗菌活性明显增强 ,提示在 FAL L - 3 9分子中增加碱性?

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达

目的 检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素 - 2 (h BD- 2 )基因的激活作用及其活性组分。方法 应用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法和 Northern杂交检测 HT- 2 9细胞 h BD- 2 m RNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成分。结果 RT- PCR和 Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下 HT- 2 9细胞无可见的 h BD- 2 m RNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的 h BD- 2 m RNA表达。结论 双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞 h BD- 2基因的表达 。

重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达

目的 探索杆状病毒表达系统 (BEVS)高效表达人 β-防御素 - 2 (h BD- 2 )的可行性及其技术路线。方法 利用特异性引物经 PCR扩增 ,从重组质粒 rpc DNA3.1/h BD- 2 /myc- His中扩增出完整重组 h BD- 2 /His基因片段。将此片段插入转移质粒 p Ac GHL T- A的多克隆位点中 ,构建成重组转移载体 rp Ac GHL T- A/h BD- 2 /His。用该重组转移载体和多角体病毒 Ac NPV DNA共转染草地夜蛾细胞 (Sf2 1) ,二者在细胞内经过同源重组形成重组病毒 r Ac NPV/h BD- 2 /His。用终点稀释分析法检测感染上清重组病毒的感染效率。采用 Western印迹法通过特异性抗 - His抗体检测细胞及上清 h BD- 2 /His的表达。结果 目的基因 h BD- 2 /His正确地插入 BEVS系统的转移载体。经 rp Ac GHL T- A/h BD- 2 /His和 Ac NPV DNA共转染的 Sf2 1细胞有较高滴度的重组病毒 r Ac NPVh BD- 2 /his存在。被共转染的 Sf2 1细胞的可溶性蛋白 ,在相对分子质量约 4 7.5× 10 3处有强反应条带显示 ,其大小与根据测序结果所推测的 h BD- 2融合肽相对分子质量接近。培养上清分别在相对分子质量约 4 0× 10 3和 30× 10 3处有强反应条带显示。结论 可利用 BEVS系统作为高效表达重组 h BD- 2的生物反应器。

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株。方法采用PCR反应从pORF-hIL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12。将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12)。结果成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变。rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌。rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带。结论分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功。

RD1／ESX-1分泌系统与结核分枝杆菌的毒力和致病性

结核分枝杆菌（MTB）全基因序列测定的完成和比较基因组学的发展，使得对MTB毒力和致病机制的认识不断深入，近年发现RD1区在MTB的致病机制中充当重要角色，而RD1区编码的ESX-1蛋白组成的分泌转运系统与MTB的毒力关系密切。此文主要从MTBRD1／ESX-1蛋白分泌转运系统对ESAT-6／CFP-10分泌输出的影响，探讨其与MTB的毒力和致病机制的关系。