微生物碱性蛋白酶的研究进展

碱性蛋白酶可源于动物、植物和微生物。微生物来源的碱性蛋白酶因其具有培养简便、产量丰富而应用尤为广泛,同时菌种筛选、纯化、诱变乃至重组工程菌技术的应用为其大规模工业化生产提供了坚实的基础。本文对微生物碱性蛋白酶产生菌的种类、高产菌株选育工作进展以及碱性蛋白酶的分类、性质、基因结构及功能等方面进行了简要概述。

微生物学教学改革的探索与实践

微生物学是生命科学等专业学生必修的专业基础课程，既是生命科学理论研究的核心，又是是一门理论性和实践性都很强的课程。在高等教育面临着素质教育、培养创新人才的新形势下，面对教学时数少，学生的知识层次不齐、实验能力较差的实际，对该课程的教学内容、教学方法和考核方法进行了一些改革，取得了较好的效果。

成纤维细胞分泌胶原蛋白与5-氟尿嘧啶的时间抑制效应

目的:观察5-氟尿嘧啶干预体外培养病理性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的作用及其时效关系。方法:实验于2005-05/2006-06在安徽医科大学微生物教研室完成。①原代细胞培养成纤维细胞:手术取4例增生性瘢痕、4例瘢痕疙瘩、4例正常皮肤组织,按文献方法进行成纤维细胞原代培养,待细胞融合后传代。②取4～6代传代细胞接种于96孔板,利用四唑盐比色法测定25g/L浓度5-氟尿嘧啶干预不同时间(1,2,5,10,15,30min)后3种体外培养成纤维细胞的增殖能力,统计得出最佳时效。③利用3H-脯氨酸掺入法检测经5-氟尿嘧啶干预不同时间后成纤维细胞的胶原蛋白分泌能力。结果:①原代培养成纤维细胞全部成活,形态良好,经5-氟尿嘧啶干预后细胞形态未发生明显变化。②四甲基偶氮唑盐法测3种不同来源成纤维细胞未干预时增殖能力,瘢痕疙瘩成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.542,P<0.01),增生性瘢痕成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.257,P<0.01);5-氟尿嘧啶干预成纤维细胞10min与5min比较,其对成纤维细胞的抑制效果增高(正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩3种成纤维细胞10minA值依次为0.389±0.027,0.418±0.051,0.554±0.021;5minA值依次为0.537±0.033,0.589±0.074,0.783±0.015,q=3.80～4.18,P<0.05),与30min比较,差异无显著性。③干预10min3H-脯氨酸掺入量与空白对照组比较明显下降,差异有显著性(q=3.82～3.96,P<0.05),与5min干预组比较,差异均有显著性(q=3.96～4.14,P<0.05),与30min比较,差异无统计学意义。结论:5-氟尿嘧啶可有效抑制病理性瘢痕及正常皮肤来源的成纤维细胞体外增殖和胶原合成,干预10min时效应最佳。

一种白僵菌中MAO抑制剂的分离纯化和结构鉴定

本研究对前期筛选出的一株具有较强的单胺氧化酶(MAO)抑制活性的白僵菌菌株Ba02进行了液体培养;通过不同提取剂的提取效果比较,发现乙酸乙酯能较好地提取出该发酵液中单胺氧化酶抑制剂。通过活性指导下的色谱分离,从乙酸乙酯提取物中得到了一种深红色粉末状化合物。活性测定结果显示该化合物在15μg.mL-1时对MAO-A和MAO-B的抑制率分别为97.50%和95.34%。MS和NMR的鉴定结果表明该化合物为卵孢菌素(Oosporein)。虽然该化合物是一已知化合物,但其对单胺氧化酶的抑制活性尚属首次发现。

黄芪总苷对血吸虫卵抗原活化的肝星状细胞增殖与胶原合成的影响

目的观察黄芪总苷对血吸虫卵抗原活化的肝星状细胞增殖与胶原合成的影响。方法小鼠腹腔注射日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Solub le egg antigen,SEA),制备SEA活化的腹腔巨噬细胞条件培养基(Solub le egg antigen inducedm acrophage cond itioned m ed ium,SEA-MCM)。采用肝星状细胞株HSC-T6细胞,以细胞增殖抑制率为指标,用噻唑蓝(MTT)测定黄芪总苷对SEA-MCM诱导的HSC-T6细胞增殖的影响;通过3H-脯氨酸参入法测定黄芪总苷对SEA-MCM诱导的HSC-T6细胞胶原合成的影响。结果SEA-MCM能明显促进HSC-T6细胞的增殖和胶原合成。黄芪总苷(32.5、65和130 mg.L-1)对SEA-MCM诱导的HSC-T6细胞增殖及胶原合成有明显的抑制作用,且呈药物浓度依赖性关系。结论黄芪总苷对SEA-MCM诱导的肝星状细胞增殖及胶原合成有明显的抑制作用。

柯萨奇B_(3m)病毒感染Balb/c鼠接种浓度的研究

通过柯萨奇Ｂ３ｍ病毒（ＣＶＢ３ｍ）接种Ｂａｌｂ／ｃ鼠浓度的研究，探索其与ＣＶＢ３ｍ的ＬＤ５０、血清抗体、病毒分离和脏器病理变化之间的关系，以获得产生明确病毒标志的最合适病毒接种浓度来筛选抗病毒性心肌炎药物。结果表明：有规律的病毒标志为小鼠的死亡率、中和抗体水平和病毒血症，腹腔接种１ＬＤ５０可使小鼠于第５天血清中和抗体效价≥１∶１６０～１∶３２０，并有病毒血症，第９天病毒血症消失，小鼠开始死亡。表明此接种浓度可出现有利于药物筛选的病毒标志。

三种方法检测乙型肝炎YMDD变异的比较研究及临床结果分析

目的对检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的3种方法进行灵敏度和特异性比较,并结合患者治疗前HBV DNA载量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平免疫标志物和YMDD变异后HBV DNA载量等临床信息进行结果分析。方法分别以荧光定量PCR(FQ-PCR)、通用模板信号扩增PCR(UT-PCR)和聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫吸附法(PCRmnh-ELISA),对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者,进行HBV YMDD变异检测,比较3种方法的敏感性,并对3种方法检测结果不一致的标本进行测序,比较他们的特异性。结果FQ-PCR、UT-PCR和PCRmnh-ELISA对YMDD变异的检出率分别为:53.85%、48.08%、73.07%,FQ-PCR和UT-PCR均与PCRmnh-ELISA差异有统计学意义(P<0.05),FQ-PCR与UT-PCR差异无统计学意义(P>0.1)。检测结果不一致的17例标本进行了测序,FQ-PCR、UT-PCR、PCRmnh-ELISA与检测结果的符合率分别为94.1%、70.6%、29.4%,3者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论3种方法比较,FQ-PCR检测HBV YMDD变异具有较高的灵敏性和特异性,并能同时检测出野生株和变异的混合感染,与测序结果相符,是诊断HBV YMDD变异较好的方法。

人肺上皮细胞感染呼吸道合胞病毒后核内活性因子κB与诱导型一氧化氮合酶的表达

目的:呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞后,诱导细胞过度表达活性递质。实验拟观察呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞A549后核内活性核因子κB,诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白、一氧化氮和丙二醛表达的变化。方法:实验于2006-12/2007-05在安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验中心完成。①实验过程:将冻存的病毒株复苏后经Hep-2细胞增殖。用呼吸道合胞病毒感染体外培养的A549细胞,分别于感染4,8,16,24h后收集细胞和细胞培养上清。以未感染病毒的细胞为正常对照组。②实验评估:反转录聚合酶链反应检测诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的变化;免疫印迹法(Western-Blot)分别检测核内活性核因子κB、诱导型一氧化氮合酶蛋白的变化;用硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法分别检测细胞培养上清一氧化氮和丙二醛的表达。结果:①A549细胞中核内活性核因子κB有基础表达,经由呼吸道合胞病毒感染后,核内活性核因子κB表达升高,且随着感染时间的延长而增加。②呼吸道合胞病毒感染A549细胞后,诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白的表达均升高且有时间依赖性,24h的诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量是基础表达量的近12倍,诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达亦显著高于正常对照组。核内活性核因子κB与诱导型一氧化氮合酶的mRNA和蛋白升高表达呈正相关。③呼吸道合胞病毒感染能促进A549细胞培养上清中一氧化氮和丙二醛的表达升高,24h内细胞上清中的一氧化氮呈缓慢升高变化。结论:在呼吸道合胞病毒感染A549细胞的炎性反应中核内活性核因子κB升高,与诱导型一氧化氮合酶基因和蛋白的上升表达呈正相关。

白芍水煎剂促干扰素诱生及抗病毒作用的研究

研究了白芍水煎剂的促干扰素诱生及抗病毒作用,并在抗病毒方面,将白芍水煎剂和白芍总甙作了比较。结果表明:白芍水煎剂10g/L在试管内无直接诱生干扰素作用,可促进NDV诱生IFNα,其最适浓度为1g/L,可促进ConA诱生IFNγ,当ConA为亚适剂量时,其最适浓度为5～10g/L,当ConA为最适剂量时,其最适浓度为2.5～10g/L,皆可提高干扰素效价1～2倍。白芍水煎剂比白芍总甙具有直接抗VSV作用,所试最小剂量的白芍水煎剂(1.25g/L)能使VSV下降1.9个对数值,最适浓度(5g/L)时,能使VSV效价下降5.22个对数值。

抑癌基因PTEN对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响

目的探讨外源性PTEN基因稳定转染对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。方法应用质粒pCMV-Tag3B-PTEN和pCMV-Tag3B空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人骨肉瘤细胞株MG-63,以未转染组为对照。应用RT-PCR分析目的基因表达,MTT法分析细胞生长增殖,An-nexinV—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,荧光染色法观察细胞形态。结果pCMV-Tag3B-PTEN转染组有外源目的基因的整合和相应mRNA表达。MTT检测表明,pC-MV-Tag3B-PTEN转染组转染组活细胞数低于未转染组和pCMV-Tag3B细胞转染组。流式细胞术显示pCMV-Tag3B-PTEN转染组凋亡率高于未转染组和pCMV-Tag3B细胞转染组。荧光染色观察到pCMV-Tag3B转染组部分细胞呈现典型的凋亡细胞形态。结论外源性PTEN基因稳定转染可诱导人骨肉瘤细胞凋亡。

兔脂肪干细胞的体外成脂成骨诱导及BrdU标记情况的初步研究

目的探索兔脂肪间充质干细胞体外分离培养的方法及生物学特性,并探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记脂肪间充质干细胞的效果。方法取兔颈后脂肪采用胶原酶消化方法分离培养干细胞,诱导培养基定向成脂、成骨细胞诱导及组织化学鉴定。采用BrdU法标记干细胞,免疫组化法鉴定其体外标记情况。结果兔脂肪组织中可以分离培养出生长旺盛的干细胞,定向诱导后表现出成脂,成骨细胞的特性。BrdU可标记干细胞的核,体外标记率达95%。结论兔脂肪干细胞易于体外分离培养,具有较强的自我更新能力及多向分化的潜能。BrdU对脂肪干细胞的标记效果满意,操作简单易行。

人巨细胞病毒感染对围手术期尿路上皮癌患者免疫功能的影响

目的检测围手术期尿路上皮癌患者外周血的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和人类巨细胞病毒(HCMV)IgG和IgM抗体,了解近期HCMV感染对围手术期尿路上皮癌患者细胞免疫功能的影响。方法采集33例经病理检测确诊为尿路上皮癌的患者外周血,流式细胞仪检测外周血CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群比例,血浆ELISA法定性检测HCMV-IgG和HCMV-IgM抗体,根据HCMV-IgM抗体结果将尿路上皮癌患者分为阳性组和阴性组,比较两组患者的T细胞亚群有无差异。结果 33例患者中HCMV-IgG抗体阳性31例;HCMV-IgM抗体阳性7例,阴性26例。HCMV-IgM阳性组和阴性组之间的CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群有着显著的差异(P<0.01)。阳性组患者的CD4+T细胞的百分比显著低于阴性组,并且该组CD4+/CD8+比值亦显著低于阴性组。CD4+/CD8+的比值提示阳性组中有85%(6/7)的患者处于免疫功能低下状态,而相对于阴性组仅有11.5%(3/23)的患者处于免疫功能低下状态,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论术前检测HCMV-IgM可以很好地预测尿路上皮癌患者的细胞免疫功能,对术后辅助治疗具有指导意义。

艾灸抗小鼠流感病毒性肺炎的实验研究

目的观察艾灸对流感病毒所致小鼠病毒性肺炎的作用,为临床防治呼吸道病毒感染提供实验依据。方法用甲型流感病毒[FM]株感染小鼠,制作病毒性肺炎模型,观察艾灸、艾灸加病毒唑、单纯病毒唑和病毒对其肺指数以及死亡保护率、生命延长率的影响。结果艾灸疗法组和病毒唑+艾灸疗法组小鼠肺指数显著低于病毒组(P<0.05);病毒唑组与病毒对照组比较,有显著的差异(P<0.01);艾灸疗法组和病毒唑+艾灸疗法组与病毒唑组无明显差异(P>0.05);艾灸疗法和病毒唑+艾灸疗法组能明显提高感染小鼠的存活率和延长存活时间(P<0.05),上述两种疗法与病毒唑治疗效果无统计学差异。结论艾灸疗法能有效保护流感病毒感染的小鼠肺组织以及其生命,提示艾灸疗法是治疗呼吸道病毒感染的有效方法之一。

ITP患儿血清可溶性IL-2受体水平和T淋巴细胞亚群变化

探讨特发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患儿免疫功能变化。方法采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法对ＩＴＰ患儿进行了血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）测定和ＡＰＡＡＰ法检测Ｔ淋巴细胞亚群。结果ＩＴＰ患儿血清ｓＩＬ－２Ｒ、ＣＤ８显著升高，ＣＤ４／ＣＤ８显著下降（Ｐ＜０．０１），且ｓＩＬ－２Ｒ和ＣＤ４／ＣＤ８呈负相关（ｒ＝－０．５８１，Ｐ＜０．０１）；缓解期ｓＩＬ－２Ｒ明显下降，基本接近正常水平，而ＣＤ８、ＣＤ４／ＣＤ８比值较急性期变化不明显。

病毒性心肌炎小鼠体内γ-IFN与NO相关性研究

为探讨γ -IFN、NO在实验性病毒性心肌炎小鼠中的变化及其在病毒性心肌炎中的作用 ,以柯萨奇病毒B3亲心肌株(CVB3m)诱导的BALB/C心肌炎小鼠为研究对象 ,每隔7天观察小鼠血清中γ -IFN、心肌匀浆中NO在病程中的动态变化 ,并计算感染小鼠心肌组织光镜下病理积分。结果显示 ,BALB/C鼠感染病毒后体内γ -IFN、NO均有不同程度升高 ,急性期(第7天)最高 ,且NO的升高与γ -IFN相关(r=0.95,r2=0.9,P<0.05) ,而感染后心肌病理积分又与NO相关(r=0.66,r2=0.43,P<0.05)。结果表明 ,γ -IFN在病毒性心肌炎发病中起重要作用 ,介导NO产生以发挥抗病毒作用 ,而过分表达则可造成自身损伤 。

胶原海绵与兔软骨细胞体外三维培养的实验研究

目的 观察用人胎盘Ⅰ型胶原海绵作为兔软骨细胞体外三维培养支架时 ,软骨细胞形态学特征和功能及该支架的吸附性和组织相容性。方法 将新生兔原代和传代软骨细胞接种于人胎盘Ⅰ型胶原海绵进行体外培养 ,用光镜和扫描电镜观察细胞形态和结构及支架的吸附性和组织相容性 ,用免疫组化观察细胞Ⅱ型胶原合成。结果 以胶原海绵作为支架的传代软骨细胞能维持其形态学特征及细胞功能 ,该支架有较好的吸附性和组织相容性。

新城疫病毒在鸡胚中增殖影响因素探讨

目的探讨新城疫病毒(NDV)Ⅱ系弱毒株在鸡胚内增殖产生血凝素的最佳条件。方法将NDV按一定浓度稀释接种到鸡胚内孵育48～72h,收获鸡胚尿囊液,测定血凝效价。结果选择9～11日龄鸡胚,种子病毒稀释10-2～10-3、接种剂量为0.2～0.3ml;在36℃培养48～72h时,其鸡胚尿囊液量多且血凝效价高。弱毒系产生的NDV血凝效价高于强毒系和C30克隆系病毒。鸡胚培养较鸡成纤维细胞培养产生的NDV血凝效价高。结论鸡胚的病毒接种量和孵育温度对NDV的血凝效价的影响很大,在研究NDV的血凝能力时应注意到这些问题。

螺内酯对高糖及醛固酮诱导的肾小球系膜细胞CTGF表达的影响

目的通过研究螺内酯(SPI)对高糖(HG)和醛固酮(ALD)刺激的体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MsC)结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白表达的影响,探讨SPI的肾脏保护机制。方法将大鼠MsC分为:A组,正常对照组(5.6 mmol.L-1)、B组,高糖组(30 mmol.L-1)、C组,HG+SPI干预组(10-9,10-8,10-7mol.L-1)、D组,ALD组(5.6 mmol.L-1葡萄糖+10-7mol.L-1ALD)、E组,ALD+SPI干预组(10-9,10-8,10-7mol.L-1)。酶联免疫法检测上清液中CTGF蛋白的含量,RT-RCR法检测MsC CTGFmRNA表达。结果①正常糖浓度的培养基中可测到MsCCTGF mRNA和蛋白表达;②与A组比较,B组和D组MsCCTGF mRNA表达和上清液CTGF水平明显升高,差异有显著性;③与B组比较,C组中经10-8,10-7mol.L-1SPI干预MsC CTGF mRNA表达和上清液CTGF水平明显降低,P<0.05,但10-9mol.L-1SPI干预MsC CTGF mRNA表达和上清液CTGF水平无变化,P>0.05;④与D组比较,E组MsCCTGFmRNA表达和上清液CTGF水平明显降低,P<0.05。结论 SPI可抑制HG和ALD刺激的大鼠MsC CTGFmRNA表达和蛋白合成,该作用可能是其抗纤维化和防治肾损害的机制之一。

人巨细胞病毒原发感染BALB/c小鼠大脑皮质模型的建立

目的建立人巨细胞病毒（HCMV）原发感染BALB／c小鼠大脑皮质的模型，为进一步研究其发病机制奠定实验基础。方法分别用2×10^6、2×10^5、2×10^4、2×10^3、2×10^2PFU／ml的HCMV AD189株腹腔注射6～8周SPF级BALB／c小鼠雌雄各6只作为实验组，同时设立灭活病毒对照组和细胞对照组。1个月后取各组小鼠大脑皮质组织进行病毒分离与鉴定、PCR和RT-PCR分别检测各标本中HCMVUL83基因及UL54的转录、HE染色。结果2×10^6、2×10^5PFU／ml实验组的雌性小鼠病毒分离、PCR及RT-PCR均为阳性；HE染色可见海马区出现了明显的病理变化。雄性小鼠、低剂量（2×10^4、2×10^3、2×10^2PFU／ml）实验组、灭活病毒组和HF对照组均为阴性。结论HCMVAD169株腹腔注射6～8周龄SPF级雌性小鼠1个月可测出大脑皮质发生急性炎症反应，为HCMV所致的原发感染状态，且小鼠性别及病毒的接种量可能与感染发生存在密切关系。

用复合PCR检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的感染研究

在性传播疾病中,泌尿生殖道感染的主要病原体是淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体,目前临床上常有多种病原体混合感染[1],其临床症状相似或无明显症状,给确诊和治疗带来不便。因此我们应用多重引物ＰＣＲ(ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ),一次实验能从临床标本中检测出三种病原体...