我国犬瘟热病毒的生态学调查研究

本研究应用电子显微镜技术检查了１７种毛皮动物和野生动物的６７６份材料，从犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、猞猁、金猫等１２种动物病料中，检出含有ＣＤＶ材料４８７份。应用间接ＥＬＩＳＡ、免疫荧光和中和试验等技术检测了８种动物１５８份血清，其中从犬、狐、小熊猫、虎、金猫，狼等６种动物的１０６份血清中检出了抗ＣＤＶ抗体。应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因探针检查了４种动物的３７份材料，其中有２９份阳性。本研究证实的大熊猫、虎、狮、小熊猫、金猫、猞猁、熊、狼等动物对犬瘟热病毒的感染，丰富了犬瘟热病毒生态学的内容。

小鼠精原干细胞的形态结构及其细胞化学和免疫组化特性

应用光镜、电镜观察了 ７～８ ｄ 小鼠精原干细胞的形态结构特点；应用细胞化学、免疫组织化学方法研究了体外培养小鼠精原干细胞的细胞化学和免疫组织化学特性。结果显示，精原干细胞呈圆形，直径（９±１） μｍ ，核大，呈圆形或轻微卵圆形，胞质较少；核内常染色质占绝对优势，异染色质极少；胞质内核糖体、线粒体较丰富，其他细胞器不发达；精原干细胞 Ａ Ｋ Ｐ染色呈阳性或强阳性，胞质内脂滴很少或没有；精原干细胞表达特异的 ｃｋｉｔ 受体；体外培养的小鼠精原干细胞常呈不完全的胞质分裂，细胞间由细胞间桥相连而呈链状或团状的细胞群丛，细胞群常由偶数细胞组成。

以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究

以在Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达的猪瘟病毒Ｅ２基因主要抗原编码区（ｍＥ２）为抗原，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗猪ＩｇＧ为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经检测筛选出最佳反应条件为：１２μｇ／孔纯化的Ｅ．ｃｏｌｉ表达的ｍＥ２重组蛋白包被酶标板，用１０％的兔血清或马血清进行封闭，以正常Ｅ．ｃｏｌｉ裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组ｍＥ２蛋白作为诊断ＨＣＶ抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。

犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。

土壤病原菌对连作大豆的致病性初探

研究了正茬及重茬大豆根际土壤中微生物区系的变化。结果表明：细菌总数在整个大豆生育期内占绝对优势，重茬低于正茬。放线菌数量总体变幅不大，真菌数量变化很大，重茬高于正茬。连作大豆根际土壤中有益真菌减少，有害真菌增加。真菌优势菌群中的尖镰孢菌、半裸镰孢菌和粉红粘帚菌回接大豆，均产生不同程度的致病性，导致大豆根腐病的发生，花期前后（３８～５０ｄ）病症明显。半裸镰孢菌和粉红粘帚菌对大豆的致病性及导致根腐病的发生尚未见资料报道。

应用三甲胺评价鱼类新鲜度与TVBN/TMA比值的研究

对四种淡水鱼和两种海产鱼在贮存过程中的三甲胺(TMA)和挥发性盐基氮(TVBN)含量变化情况进行了时间跟踪,结果表明,鱼体中TMA含量与TVBN含量高度正相关;TMA指标不仅能判定海产鱼类的新鲜度,而且也可作为淡水鱼的鲜度指标。探讨了用TVBN/TMA比值评价海鱼和淡水鱼新鲜度的适用性。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析

将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列，并证明其具有正确的阅读框架。

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１，与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接，转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。

从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株和猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株的核苷酸序列，设计合成了１对ＢＶＤＶ引物和３对ＨＣＶ引物。以从吉林、长春、哲盟３个地区经临床及病理学诊断为猪瘟的病料中提取的ＲＮＡ为模板，采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别以ＢＶＤＶ和ＨＣＶ引物进行扩增。结果，用ＢＶＤＶ引物从哲盟地区的疑似猪瘟病料中扩增出大小约４００ｂｐ的片段，而用３对ＨＣＶ引物在不同的条件下均未从该病料中扩增出相应大小的ＨＣＶ基因片段。此外，用ＨＣＶ的ＰＥ０／ＰＥ４引物从吉林、长春的病料中扩增出了ＨＣＶ的基因片段，但用ＢＶＤＶ引物从这两个地区的病料中均未扩增出ＢＶＤＶ的基因片段。从哲盟疑似猪瘟病料中扩增出的片段经克隆、序列测定及计算机分析证实，该片段的核苷酸序列和氨基酸序列与ＢＶＤＶ的同源性明显高于与ＨＣＶ的同源性。将哲盟病料接种于ＭＤＢＫ传代细胞，出现典型而规律的ＢＶＤＶ样细胞病变。由此证明。

利用桥接组合的转育方法提高玉米花药培养诱导率的研究

本 试验证明 ：１使用桥接 组合的 转育方法 ，能够使 符合当地 育种目 标的 玉米 材料 哲白２ 、 Ｂ７９ 、 Ｍｏ１７ 、 Ａ６１９ Ｈｔ 等 由原来出 愈 率为 ０ ，分 别 提高 到 ６２６ ％ 、２４３５ ％ 、１０２２ ％ 、８９４ ％ ，绿 苗 分化率分别 为０８２ ％ 、１８５ ％ 、０４４ ％ 、１９４ ％ 。２以高 诱导率 的玉 米 单复 ９５３ 为“桥”和 甜玉 米 杂交， Ｆ１进行花 药培养 ，甜玉米的 出愈 率０ ～０２５ ％ 桥接 后提 高 到２２３６ ％ 。 由此 可见 ，利 用 有性 杂 交 使有利基因 型重组后 进行花 药培养从 而快 速获 得 玉米 纯 系，建 立 了单 倍体 育 种的 新体 系， 不仅 具 有理论意义 ，还存在 着巨大的 生产潜 力。

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性。

中国旋毛虫分离株成虫和新生幼虫基因文库的构建及筛选

利用λＺＡＰⅡ载体构建了中国分离株Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌａｓｐｉｒａｌｉｓ及Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌａｎａｔｉｖａ成虫和新生幼虫ｃＤ－ＮＡ基因文库，检测结果表明，所克隆的ｃＤＮＡ片段分布在０．２～２．０ｋｂ之间，表明２个ｃＤＮＡ基因文库对ｍＲＮＡ的覆盖面很大。利用ＲＡＰＤ技术，以肌幼虫基因文库作对照，采用７０个单引物及２０对复合引物对以上２个文库进行筛选扩增，结果：（１）共获得２条Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ及４条Ｔ．ｎａｔｉｖａ的成虫与新生幼虫特异性基因片段，鉴于成虫与新生幼虫是旋毛虫的２个侵袭性阶段，其所特有的特异性基因片段极有可能就是这２个时期虫体的侵袭性因子基因，即所要寻找的强保护性抗原基因，从而为后续研究奠定了基础；（２）发现１条Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ种特有的基因片段，这一特异性基因片段为虫种鉴定提供了物质条件；（３）发现旋毛虫同种不同分离株（中国分离株及法国分离株）间ｃＤＮＡ文库扩增图谱完全相同。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

对含有产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）α毒素基因的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１），通过培养性状观察和小鼠接种试验，证明这２株重组菌株均无致病性。随后对这２株重组菌株的表达产物进行了研究，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导３～４ｈ后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白３３．２１％，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白２７．２５％，其相对分子质量约３７５００；经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明，以１倍致死量攻击的免疫小鼠可获得１００％（３６／３６）的保护，以２倍致死量攻击的免疫小鼠可获得９４．２８％（３３／３５）的保护，从而说明表达产物具有良好的免疫原性。

家兔的超数排卵

应用国产激素制剂对大耳白、青紫兰和比利时３种家兔进行了超数排卵处理，系统研究了品种、激素剂量、发情周期、重复超排间隔时间以及体重、季节等因素对超排效果的影响。实验结果表明，１）ＰＭＳＧ和ｈＣＧ对３种家兔超排处理的最适剂量有差异，大耳白兔为１３０ＩＵ剂量组最好（平均获卵２４．３８±５．５７个），青紫兰兔为１１０ＩＵ剂量组最佳（平均获卵２６．００±４．３１个），而比利时兔的剂量效应不明显（１３０ＩＵ剂量组好于其他各组，平均获卵１６．００±２．３５个）；２）同种家兔间隔１～２个情期与间隔３～４个情期重复超排效果差异不显著（Ｐ＞０．０５），且分别与各自初次超排效果相比也相差不显著（Ｐ＞０．０５）；３）发情周期不同阶段开始超排效果不同，大耳白兔和青紫兰兔发情早期至发情晚期的超排效果显著（Ｐ＜０．０５）或极显著（Ｐ＜０．０１）好于间情期；４）以１２０ＩＵ～１３０ＩＵ剂量进行超排处理，体重在２．００～２．９９ｋｇ的青紫兰兔的超排回收卵数为２６．３８±７．４７个，极显著多于体重在４．００～４．９９ｋｇ的青紫兰兔（获卵１３．７５±４．８５个）（Ｐ＜０．０１）；５）大耳白兔在１０～１２月份的超排回收卵数为２５．７３±６．２８个?

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后，进行了序列测定。序列分析表明，该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ，编码５５３个氨基酸，序列中有６个糖基化位点，１３个半胱氨酸残基，裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ，与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符，证明长春株为弱毒株。同源性分析表明，长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比，核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间。

用PCR鉴定大肠杆菌O157∶H7

根据大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的编码ｅａｅ蛋白的ｅａｅＡ基因和大肠杆菌编码Ｈ７抗原的ｆｌｉＣ基因的核甘酸序列，合成了２对寡核苷酸引物，建立了一个检测大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ＰＣＲ方法。对１１株已知大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ；无运动性）株和其他不同属的４２株已知肠道致病菌的检测结果表明，该方法只从大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）株的ＤＮＡ中产生预期的扩增产物，而从其他菌株的ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ产物。该方法从基因水平直接确定大肠杆菌的血清型，特异性强，克服了以往血清学方法有非特异性反应的缺陷，为检测和鉴定大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）提供了一个新方法。

赤芝子实体中灵芝酸类成分的研究

自赤芝［Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ（Ｆｒ．）Ｋａｒｓｔ．］子实体的二氯甲烷提取物中分离得到一个新的四环三萜化合物，命名为灵芝酸ＤＭ（ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＤＭ，Ｉ）。根据光谱（ＵＶ，ＩＲ，１ＨＮＭＲ，１３ＣＮＭＲ，ＭＳ２ＤＮＭＲ）分析，确定其结构为Ｉ式。同时还分离得到二个已知的灵芝酸类化合物，即灵芝酸Ａ（ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＡ，Ｉ）和灵芝酸Ｃ（ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＣ，ＩＩ）。

犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析

对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定，并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增，将扩增得到的 ４ 个阳性 Ｐ Ｃ Ｒ 片段纯化后直接测序。将所测序列拼接后，去掉侧翼的 Ｆ 基因和 Ｌ 基因序列，得到了 Ｈ蛋白的全基因序列。该基因全长为 １ ９４６ ｂｐ，开放阅读框架（ Ｏ Ｒ Ｆ）始于 ２１～２３ 位的 Ａ Ｔ Ｇ，终止于 １ ８４２～１ ８４４位的 Ｔ Ｇ Ａ，编码 ６０７ 个氨基酸。将 Ｌ Ｉ Ｕ 毒株与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株进行比较，二者 Ｈ 基因核苷酸序列的同源性为 ９１．７％ ，推导的 Ｈ 蛋白氨基酸序列的同源性为 ９０．２％ 。 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株的 Ｈ 蛋白潜在的 Ｎ 联糖基化位点为 ４ 个，而 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白为 ８ 个。糖基化位点的不同可能对 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白的抗原性产生影响。２ 个毒株 Ｈ 蛋白的半胱氨酸残基数目均为 １２ 个，且位置是保守的；疏水性有一定的不同，但推测的穿膜区位置是相同的，位于 ３５～５５ 位氨基酸之间。

肌注狂犬病病毒糖蛋白cDNA表达载体诱导的小鼠体液免疫反应

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段分别正向插入ｐｍＭＴ－１ＢｇｌⅡ位点和ｐＭＴ０１０／Ａ＋ＢａｍＨＩ位点，构建重组质粒ｐｍＭＴ－Ｒｇｐ和ｐＭＴ０１０／Ａ＋－Ｒｇｐ，通过磷酸钙共沉淀法转染ＢＨＫ－２１细胞，经ＰＣＲ、打点杂交及ＥＬＩＳＡ检测，证明糖蛋白基因发生了整合并获得表达。以该表达载体给小鼠肌肉内注射２～３次，采其注射前、后双份血清，经ＥＬＩＳＡ检测证明，注射了表达载体的小鼠，血清中病毒特异性抗体明显升高，表明狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ在小鼠体内表达后。