猪流行性腹泻病毒YL株分离鉴定及仔猪感染试验

从腹泻仔猪肠道组织中分离获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)地方分离株,并对其致病性进行初步分析。对陕西某养殖场采集有腹泻症状3~5日龄仔猪的十二指肠,经RT-PCR检测为PEDV核酸阳性。将阳性样品处理后接种Vero细胞进行病毒分离,并对分离毒株进行病毒含量测定、致病性试验。结果显示,分离到1株PEDV毒株(命名为YL株)。将分离的PEDV病毒液以不同滴度口服接种健康仔猪,2.0 mL/头,发现10^(5.5)TCID_(50)/mL剂量组接种1日后,100%(3/3)试验猪出现腹泻症状。

猪流行性腹泻灭活疫苗毒株的培育

为培育出毒力弱、病毒含量高、免疫原性好的猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗株,将PEDV-YL株在Vero细胞上连续传代并进行噬斑克隆纯化,测定病毒含量后进行毒力试验及免疫原性试验。结果显示:将健康仔猪接种F22代clone6、clone7毒种后,试验猪均表现出腹泻症状且均能检测到PEDV,剖检后各脏器未见异常;攻毒保护率为60%,各脏器均未出现病变。健康仔猪接种F32代clone10、clone12毒种后,60%试验猪出现腹泻症状且检出PEDV,剖检后各脏器无明显变化;一次免疫组攻毒保护率为60%~80%,二次免疫组为100%,各脏器均未发生病变。F32代clone10病毒含量略低于clone12且两者免疫原性相当。结果说明:PEDV-YL株F32代clone12更适合作为疫苗研制候选毒株,且二次免疫保护效果更好。本研究为猪流行性腹泻灭活疫苗研发提供了技术支撑。

猪流行性腹泻灭活疫苗佐剂筛选

为探究不同佐剂对猪流行性腹泻灭活疫苗免疫效果的影响,选用水包油佐剂A(O/W)、油包水佐剂B(W/O)和双相佐剂C(W/O/W)3种不同佐剂配制疫苗,分别接种3~5日龄仔猪后攻毒,综合评价不同佐剂的免疫效果。结果显示:A、B佐剂组疫苗免疫猪的抗体水平低于C佐剂组;攻毒后进行猪流行性腹泻病毒检测发现,仅C佐剂组试验猪全部呈阴性;剖检所有疫苗免疫组试验猪均未发现脏器病变。结果说明:双相佐剂制备的灭活疫苗免疫效果明显优于水包油和油包水佐剂疫苗,且安全性较高,可优先选择双相佐剂制备猪流行性腹泻灭活疫苗。本研究为猪流行性腹泻疫苗制备、生产提供了技术支撑。

猪丁型冠状病毒的分离鉴定与基因分析

对山东省某养殖场的腹泻病料进行检测,确认为猪丁型冠状病毒(PDCoV)阳性。使用ST细胞分离到一株PDCoV,命名为SD株。全基因序列测定以及与GenBank中其他68株PDCoV全基因序列比对分析以及遗传进化分析结果表明:PDCoV SD株的全基因组(不包括3'poly(A)尾)序列长度为25414个核苷酸(nt),与参考株HKU15-155、CH/Sichuan/S27/2012和CH-HB-2014的核苷酸同源性分别为98.97%、99.06%和99.13%;此外,在nsp2区的1739~1744位(对应于HKU15-44序列)中的6 nt(TTTGAA)缺失和nsp3区的2810~2818位的9 nt(TCGGCAATG)缺失为特征性基因突变;69株PDCoV呈现出明显的地域特征,其中美国与韩国的PDCoV毒株为一个大分支,越南与泰国PDCoV毒株为另一个小分支,中国的23株PDCoV则呈现出4个小分支,充分展现了该病毒的基因多样性。试验可为中国PDCoV的流行病学和诊断研究以及进一步的疫苗开发提供参考。

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定和遗传进化分析

从陕西地区26个疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场,采集发病仔猪的肛门拭子、粪便以及死亡仔猪的小肠,将其接种于Vero细胞,在添加胰酶的情况下,连续传代培养并观察,直至细胞出现典型的合胞体病变,经RT-PCR检测、测序、基因比对分析与动物回归实验,最终确定分离到一株PEDV病毒强毒株。经过测定毒株的S基因序列,进行序列比对分析和遗传进化分析,发现本次分离到的毒株与疫苗株CV777同源性较低,进化分支位于目前流行的PEDV G2a亚群。

鸡胚接毒量对新城疫病毒LaSota株增殖的探究

本研究旨在生产鸡新城疫低毒力活疫苗时,获得高效价、高收量的制苗用抗原。本研究从SPF鸡胚接种新城疫病毒LaSota株种毒用量方面进行探索试验,研究鸡胚接毒量对新城疫病毒LaSota株增殖的影响,从而确定SPF鸡胚生产新城疫病毒LaSota株抗原的理想接毒量。结果显示,使用SPF鸡胚增殖新城疫病毒LaSota株抗原,鸡胚尿囊腔接种种毒量为10000EID;/胚时,能达到满意的效果。这为SPF鸡胚高效生产新城疫病毒LaSota株抗原,提供了科学的指导与方法。

2种佐剂在猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗中的效果比较

为给猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗选择一种理想的佐剂,以增强机体对抗原的适应性免疫应答,协同提高动物免疫力。实验用水包油Merckinade SDA 25佐剂和双向Montanide ISA 206佐剂,分别按各自说明制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗,再对两种佐剂的疫苗进行稳定性、黏度、安全及效力检验,比较评价出猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的理想佐剂。结果表明,两种佐剂疫苗的稳定性、黏度、安全均合格,无明显差异;但Montanide ISA 206佐剂疫苗较Merckinade SDA 25佐剂疫苗诱导抗体效价更高。据此,笔者认为,Montanide ISA 206佐剂是猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗比较理想的佐剂。

不同佐剂对猪流行性腹泻灭活疫苗免疫效果的影响

为了探究不同佐剂对猪流行性腹泻灭活疫苗免疫效果的影响,本试验用水包油佐剂Merckinade SDA 25、油包水佐剂Montanide ISA 61 VG和双向佐剂Montanide ISA 2063种不同佐剂制成猪流行性腹泻灭活疫苗,然后用疫苗免疫动物,于免疫后21日测定中和抗体,并于免后21日攻毒,攻毒10日后观察猪的临床症状、检测排毒情况并于剖检后观察脏器变化情况,综合评定免疫效果。结果显示,用双向佐剂Montanide ISA 206制成的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂制成的疫苗。这为商品化生产高效价猪流行性腹泻灭活疫苗时佐剂的选择提供了重要的依据,具有现实指导意义。

温箱和水浴加热法中和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的效果比较

为明确“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”效力检验项病毒中和的条件参数,使检验数据能真实反映疫苗效价的目的。该研究对“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”的两种类型LaSota株+H120株和LaSota株+H52株进行效力检验,采用温箱、水浴两种方法在不同温度下进行病毒与对应阳性血清中和。结果显示,阳性血清在25℃以上水浴法及30℃以上温箱法均可完全中和病毒,但30℃的水浴法及温箱法中和会对另一种不予中和的待测病毒带来损伤,导致检验数据不可靠。可见,“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”效力检验时,病毒与阳性血清的中和宜采用25℃水浴法1h。

温度对鸡传染性支气管炎病毒增殖的影响

为了在生产鸡传染性支气管炎活疫苗时,获得高效价的制苗用病毒液,该文从无特定病原体(SPF)鸡胚接种后的孵育温度方面进行探索,研究温度对鸡传染性支气管炎病毒增殖的影响。结果显示,在用SPF鸡胚增殖鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株时,以鸡胚液病毒含量指标衡量,接种后的鸡胚在35~37℃孵育为宜,在35.5~36.5℃孵育为佳,超过37℃或低于35℃孵育,不论接毒量大小或孵育时间长短,其鸡胚液的病毒含量均不达标,且37℃以上对鸡传染性支气管炎病毒的增殖更不利。鸡传染性支气管炎病毒对温度比较敏感,鸡胚增殖时,应尽量控制接种鸡胚在35.5~36.5℃孵育,不要超过37℃,为鸡传染性支气管炎鸡胚病毒液的高效生产提供了方法与指导。

甲醛灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳条件研究

为探究甲醛对猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液最佳的灭活条件,本试验采用10%的甲醛溶液与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液混匀,使甲醛终浓度分别达到0.05%、0.07%、0.10%、0.15%、0.20%,在4~8℃下经过不同时间的灭活,通过对灭活液不同时间点的无菌检验及灭活检验,综合判定灭活效果。结果显示:猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液在甲醛终浓度为0.07%时灭活72h,或甲醛终浓度为0.10%和0.15%时灭活60h,或甲醛终浓度为0.20%时灭活48h,均取得可靠的灭活效果。考虑到甲醛的毒副作用,笔者认为4~8℃下用0.07%甲醛终浓度灭活72h是比较理想的灭活条件。