双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%(121/121),检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显提高灵敏度,达到93.3%(14/15)。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的制备和鉴定禽流感病毒（H5N1）血凝素（H5）特异性单克隆抗体（mAb）,建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。方法以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制（HI）实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。结果获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1∶100-1∶51200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性。结论建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断。

中国H3亚型流感病毒生态学与分子进化的研究

病毒生态学与分子进化是一门新兴的学科 ,研究病毒在各种环境中的关系 ,可以为今后病毒的研究与防治奠定基础。本研究首次详细对我国 14株鸭、鸡等禽流感和马、猪等动物的流感病毒的生态学与分子进化进行了分析研究 ,初步摸清了这些病毒在我国的流行与进化情况 ,为今后流感病毒疫苗的应用奠定了理论基础 。

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

目的制备和鉴定B型流感病毒核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA检测B型流感病毒N抗原。结果获得12株特异性针对B型流感病毒N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100%,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9%,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100%。结论获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。

双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉Afmp1cr/Afmp2cr抗体

目的建立检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法用毕赤酵母系统表达重组的烟曲霉特异性甘露聚糖蛋白片段Afmp1cr和Afmp2cr,经棋盘滴定法建立可检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。用Afmp1cr和Afmp2cr分别免疫兔血清评估方法灵敏度,健康人血清、其它微生物感染者血清评估特异性,并检测曲霉感染者血清。结果 Afmp1cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶800稀释兔多抗血清中的抗体,Afmp2cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶3200稀释兔多抗血清中的抗体,两者均与其他真菌及细菌无交叉反应。2例确诊曲霉感染和1例拟诊曲霉感染患者血清中能检测出抗体。结论初步建立了检测anti-Afmp1cr/Afmp2cr抗体的双抗原夹心ELISA方法,可辅助诊断临床烟曲霉感染。

A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

目的制备和鉴定A型流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体,建立A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法,用于A型流感病毒感染的实验室早期诊断。方法利用杆状病毒系统表达A型流感病毒核衣壳蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定,用双抗体夹心ELISA捕获法建立检测A型流感病毒核衣壳蛋白的方法。结果获得8株、共识别4个A型流感病毒核衣壳蛋白不同抗原位点的单克隆抗体,选择以单抗2B8A11作为捕获抗体,以C16A15作为检测抗体为最佳抗体对,建立双抗体夹心ELISA捕获法。检测流感患者的当日采集和冻存的呼吸道标本,与病毒分离培养方法的符合率分别为100%和42.9%;与B型流感病毒和其他呼吸道病毒无交叉反应。检测流感患者当日采集的呼吸道标本敏感性高于德国Serion试剂盒(P<0.001),与RT-PCR方法比较差异无显著性(P=0.5)。结论成功建立了灵敏度高、特异性强的A型流感病毒核衣壳蛋白抗原的ELISA捕获法,为A型流感病毒感染的实验室早期诊断提供技术方法。

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对 1株H9N 2亚型禽流感病毒 (AIV)A/Chick/Shandong/ 6/ 96(H9N2 )进行了全病毒基因序列分析。结果表明 ,该毒株 8个基因的核苷酸序列皆与 1994年分离株A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )具有很高的同源性 (96.0 %—98.6% ) ;推导其血凝素 (HA)裂解位点处的氨基酸序列为A R S S R ,完全符合H9AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94亚分支的特征 ;虽然其神经氨酸酶 (NA)基因与A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H 9N2 )相比 ,出现了 9个核苷酸的缺失 ,然而其同源性仍然较高 ,为 97.3 % ;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/ 3 2 3 / 96和类A/Quail/HongKong/G1/ 97亚分支的同源性却相对较低 ,分别为 92 .0 %和 84.2 % ;其它基因的比较情况也大体相近。提示该毒株是由 1994年分离株进化而来 ,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )亚分支。

戊型肝炎病毒重组疫苗的初步实验研究

应用重组大肠杆菌表达的代表HEVORF2C端约 1 /3长度基因片段的重组蛋白作为疫苗 ,进行了猕猴接种及HEV攻击实验。结果显示 ,猕猴接种疫苗后可产生高效价的抗体 ;在同株HEV攻击后 ,疫苗组 3只猕猴除 1只出现 1次粪便标本HEVRNA阳性外 ,其他未见粪便排毒和HEV血症 ,而对照组 3只猕猴均出现粪便排毒 ,并持续 9～ 1 3天 ;其中 2只外周血单个核细胞可检测到HEVRNA ,且 1只出现ALT异常。上述结果表明 ,该疫苗可有效地保护猕猴对同株HEV的攻击 。

禽流感病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备及其特异性分析

为研制禽流感病毒(H5N1)非结构蛋白1(NS1)的特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性,本研究在分别表达了具有良好抗原性的A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白基础上,用A/Viet-nam/1194/04(H5N1)-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光和免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制实验对单抗识别的抗原位点进行分析。结果共获得19株能识别4个H5N1-NS1蛋白不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,5株为IgG2a、1株为IgG2b,另外13株为IgG1。这些mAb均与A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白特异性结合,免疫荧光检测均与A型流感病毒(H1N1和H3N2)有交叉反应,而与B型流感病毒无交叉现象。表明成功获得特异性针对H5N1-NS1蛋白的mAb,为进一步研究禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能奠定基础。

抗马尔尼菲青霉单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗马尔尼菲青霉单克隆抗体(mAb)。方法用基因重组马尔尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1)抗原免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株稳定分泌抗马尔尼菲青霉mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定均为IgG1,抗体亲和常数分别为8.2×10-9、4.7×10-9、6.5×10-9和2.7×10-9,免疫印迹证实马尔尼菲青霉mAb特异性识别MP1。结论4个杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高,为马尔尼菲青霉病的快速诊断奠定了基础。

庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究

利用原核表达载体 pRSET或 (和 )pGEX在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒 (HGV)C NS3和NS5区的多段基因。CE1、E2、NS3、NS5及NS3 NS5嵌合基因等的 8段基因均有高效表达 ,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在 10 %～ 35 %之间。对以上重组蛋白进行免疫学筛选 ,证实其中 7个重组蛋白均具免疫学活性 ,在一定程度上确定了重组HGV抗原表位的分布 。

血中检测SARS冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用

为明确严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用,通过微量中和试验及酶联免疫方法、间接免疫荧光法检测疑似病人恢复期血清(大于28天)中SARS IgG抗体,确诊SARS患者。同时收集发病不同时期SARS及普通发热病人血清,利用酶联免疫方法检测SARS CoVN蛋白,并与荧光定量PCR早期诊断方法相比较。共检测:广州地区2003年12月～2004年1月新发4例确诊SARS患者不同时期的血液和咽漱液标本;恢复期血清SARS CoV中和抗体阳性病人不同时期的血清46份;广州地区2003年1月～4月临床确诊SARS患者159例的血清和56例疑似患者血清;非SARS普通发热病人血清97份;正常人体检血清100份。结果:4例新发SARS患者的不同时期标本中,3例患者急性期血均检出N蛋白,优于常用的荧光定量PCR检测方法。46份SARS CoV中和抗体阳性的血清标本,N蛋白检出率为100%。159例临床确诊病例中,发病早期5天以内SARS CoVN蛋白的检出率为92 3%,随后呈现逐步下降的趋势,在发病第18天仍可检出。56例临床疑似患者发病早期也有23 2%检出率。而97例普通发热病人及100份正常人血清中均未能检测出SARS CoVN蛋白。表明在血清中检测SARS冠状病毒N蛋白的方法敏感性和特异性都好,对SARS实验室早期诊断具有重要作用。

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。

血清EB病毒抗体EBNA1 IgA检测临界值探讨

目的:通过对健康人群与鼻咽癌患者EB病毒抗体EBNA1IgA水平的分析,探讨在鼻咽癌高发区应用该抗体作为鼻咽癌血清学指标时临界值的确定。方法:采用ELISA法检测780例健康人和104例鼻咽癌患者血清EB病毒EBNA1IgA,根据灵敏度和特异度曲线分别选择灵敏度、特异度在95%所对应的rOD值作为阴性临界值和阳性临界值,根据该临界值将人群划分成3个不同等级,rOD≥1.85为阳性,1.85>rOD≥1.10为可疑阳性,rOD<1.10为阴性。结果:健康人群EBNA1IgA的均值是0.850±0.637,鼻咽癌患者为2.241±0.875。健康人群中EBNA1IgA阴性、可疑阳性和阳性人群分别占75.13%、17.44%和7.44%,而鼻咽癌患者则分别是4.81%,17.31%,77.88%。结论:鼻咽癌高发区人群血清EBNA1IgA的rOD值离散程度较大。以EBNA1IgA作为鼻咽癌血清学诊断指标,可根据灵敏度和特异度确定阳性、可疑阳性和阴性3个人群,以利于临床作出对鼻咽癌的辅助诊断。

甲型H1N1流感病毒在季流病毒、禽流感病毒共感染时变异可能性的验证

目的甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009分别与A/Brisbane/10/07和A/ShenZhen/406H/06共感染小型香猪,预测甲流病毒在与季流H3N2病毒/甲流病毒与禽流感病毒共感染时是否会发生变异。方法分别将A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)对5～6月龄小型猪共感染,小型猪经复方氯胺酮0.1 mL/kg麻醉后进行滴鼻感染,感染后第5天安乐死动物,取动物肺组织作病毒测序分析。结果 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2)共感染后,A/California/7/2009病毒PB1基因993位G→A突变,PA基因1659位G→A突变,没有氨基酸的变异。A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后A/California/7/2009病毒PB2基因1711位T→C突变。碱基的突变未引起氨基酸的变异。结论 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后在猪的体内没有发生病毒重组、变异。

不同期鼻咽癌病人血清中TNF－α和IFN－γ活性检测

本文研究不同期鼻咽癌病人血清中ＩＦＮ和ＴＮＦ的活性水平。结果如下：第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各期病人，复发期病人和健康对照组的ＩＦＮ水平均值分别为５３．０，７１．４，６３．４，３２．８，５３．０和２１．０ＩＵ／ｍｌ，经方差分析各期病人和对照组之间有明显差异，Ｆ＝１１．６９９，Ｐ＜０．０００１。第Ⅰ－Ⅳ期各期病人以及复发期病人和健康对照组的ＴＮＦ水平均值分别为９９．５，１１５．３，１２１．２，２３５．４，８２．８和１１．４ＩＵ／ｍｌ。经方差分析各期病人和对照组之间有明显差异，Ｆ＝９．３９２８，Ｐ＜０．０１。值得注意的是第Ⅳ期病人的ＩＦＮ水平下降，而ＴＮＦ水平上升。中和试验确证病人血清中ＩＦＮ为γ型，ＴＮＦ为α型。本文讨论有关第Ⅳ期这两种细胞因子水平的分叉现象：ＩＦＮ－γ下降和ＴＮＦ－α上升与此肿瘤远距离转移和恶液质出现的关系。

在鼻咽癌高发区采用风险评估方案和高危人群随访检出早期鼻咽癌

目的：局限于鼻咽的鼻咽癌可以通过放射治疗治愈,但临床发现的患者通常处于晚期,预后较差。本课题在健康成人体检中检测EB病毒3种抗体,确定鼻咽癌高危人群,以探讨提高早期鼻咽癌筛查效率的方法。方法：2007-03-16-2007-12-31对在中山市人民医院进行健康体检的1 373名健康人群血清采用EB病毒EBNA1/IgA、Zta/IgG、EBNA1/IgG检测,根据EB病毒抗体水平对该人群分层评估：高危组、中危组和低危组。对高危组每3~6个月追踪随访,其他组在门诊和肿瘤登记系统进行随访。结果：随访至2009年7月31日,高危组11例中有5例确诊鼻咽癌,其中包括在直接筛查和临床随访中检出的3例无症状（T1N0M0）鼻咽癌。高危组鼻咽癌检出率为45.45%,该体检人群鼻咽癌检出率为0.8%。其他组随访28个月未发现鼻咽癌。结论：采用鼻咽癌风险评估方案进行鼻咽癌筛查可缩小普查需跟踪的人群的范围（11/1 373）,提高鼻咽癌筛查效率,检出早期鼻咽癌;对评估高危的人群密切跟踪及随访是发现早期无症状鼻咽癌的关键。

EB病毒基因组限制片段长度多态性(RFLP)在鼻咽组织中的分布

利用PCR和限制性内切酶分析,探讨了EB病毒基因组限制片段长度多态型(RFLP)在正常鼻咽组织,鼻咽癌组织和口腔上皮脱落细胞中的分布情况。结果表明在正常鼻咽组织的EB病毒感染是一种普遍现象并且感染可能发生在癌变前;EB病毒基因组BamHF区的RFLP在鼻咽癌组织和正常的鼻咽组织之间有不同的分布;不同EB病毒RFLP变型(variant)的混合感染在正常咽组织比在癌组织中普遍,这结果表明可能在癌变发展过程中,由于部分带有EB病毒的细胞的选择生长,结果使得癌组织中的细胞以一种EB病毒变型为主;本文探讨了EB病毒的RFLP变型在鼻咽组织和口腔上皮脱落细胞分布的关系,这种关系可能为鼻咽癌高发区的癌变检测提供一种简单可靠的方法。

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1（NS1）抗原检测的酶联免疫吸附（ELISA）法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97（H5N1）-NS1和A/Vietnam/1194/04（H5N1）-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.