基因HC56对人肝癌细胞(SMMC7721)基因表达水平的影响

目的 观测新发现的HC56基因对培养的人肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响。方法 用含HC56 cDNA的重组表达载体转染 SMMC-7721细胞后,由细胞总RNA反转录为cDNAs,与Atlas人类cDNA表达方阵膜片杂交,通过molecular image system分析软件对暴光强度进行密度扫描定量(以看家基因β-actin对照校正)。结果HC56转染的肝癌7721细胞有3个基因(C-myc,CAMP dependent proteinkinasetypel beta regulatory subunit β,thymosin β-10)表达上调,3个基因(Glutathione perotidase,fos-related antigen-2,zinc fingerprotein l)表达下调。结论HC56基因转染对体外培养的肝癌细胞的基因表达有不同的影响。本文为进一步研究HC56基因的功能提供了线索。

女性肺癌组织中癌基因产物的表达

人肿瘤的发生与某些原癌基因的活化有密切关系,ras族和myc族基因是人类肿瘤常见的癌基因。许多人曾报道在人的肺癌组织或细胞株中有Ki-ras或/和C-myc基因的放大、突变活化或异常表达。癌基因是通过其产物而起生物学作用的,为了探索癌基因产物在癌变过程中的作用及其应用价值,首先必须得到大量的基因产物,我室曾构建了V-Ki-ras和V-myc的表达质粒。本文主要报道抗V-Ki-ras、V-myc基因产物多克隆抗体的制备及应用多克隆抗体以免疫印迹法检测女性肺癌组织中Ki-ras和C-myc的产物。

鸭乙型肝炎病毒表面抗原表达质粒的构建及鸭血清中DHBsAg的初步检测

用重组DNA技术构建了鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的Pre S/S的表达质粒——D.F.W.29,表达的融合蛋白分子量为30kd。用SDS-PAGE分离细菌蛋白,经考马斯亮蓝染色、激光光密度扫描定量分析表明,DHBV的pre S/S表达的融合蛋白占细菌总蛋白的16字。将此融合蛋白免疫家兔,可获得相应抗体。免疫印迹法(Western blot)测抗体灵敏度,证明和该抗体呈现阳性反应的最低抗原量为3μg。用此抗体检测鸭血清中DHBsAg的初步结果表明,它与鸭血清DHBV DNA斑点杂交结果基本相符。因此,该抗体可以用作检测鸭乙型肝炎病毒携带状态并可用于研究鸭肝癌与肝炎的关系。

启东地区鸭肝癌中人HBV变异体蛋白产物的表达

本文分析了启东鸭肝癌组织中人ＨＢＶ变异体的蛋白产物。用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ方法检测１２例启东鸭肝癌组织中人ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢｘＡｇ的表达。９例标本检测到３５ｋｄ和（或）大于３５ｋｄ的ＨＢｓＡｇ。７例标本出现２４ｋｄ的ＨＢｃＡｇ。９例标本有ＨＢｘＡｇ的表达，其分子量为１２ｋｄ和（或）２５ｋｄ。本文同时也分析了ＤＨＢＶ基因产物ＤＨＢｓＡｇ。７例鸭肝癌标本检测ＤＨＢｓＡｓ，４例阳性，分子量为４０ｋｄ。这些结果进一步证明启东鸭肝癌中确实存在ＨＢＶ变异体，而且ＨＢＶ变异体ＤＮＡ具有表达活性。

高通量肿瘤血管新生研究技术平台的建立

目的 建立高通量肿瘤血管新生研究的体内外技术平台。方法以VEGF,bFGF为血管新生因子,以Thalidomide血管新生抑制因子对体外培养的血管内皮细胞系(RF/6A,SVEC)应用MTT试验,迁移试验,浸润试验和管状形成试验检测内皮细胞的各种特性;体内实验以鸡胚和C57BL/6小鼠为实验动物检测血管新生因子和抑制因子在体内对血管新生的影响。结果VEGF和bFGF在体内和体外均有促进血管新生的作用,体外试验表明VEGF和bFGF对内皮细胞的增殖活性,迁移,浸润和管状结构形成均有明显的促进作用(P＜0.01);小鼠体内栓子试验和鸡胚绒毛尿囊膜试验结果均表明,VEGF和bFGF对体内血管新生同样具有促进或刺激作用,和阴性对照相比主要表现在新生血管密度高、管腔大、管壁完整等;而Thalidomide在体内外均有明显抑制血管新生的作用。结论 本技术平台是一个高通量、经济、简便易行、实用的血管新生研究技术平台。

四环素调控的真核表达体系Hep3B Tet-On细胞株的建立

目的 建立可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体系Hep3BTet On细胞株 ,用于基因功能的研究。方法 将pTet On质粒用脂质体介导法转染Hep3B细胞 ,经G4 18筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆分别扩增后 ,瞬时转染pTRE luc(编码荧光素酶蛋白 )质粒 ,Dox诱导表达后 ,检测荧光素酶活性 ,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的Hep3BTet On细胞株。结果 成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的Hep3BTet On细胞株。结论 Hep3BTet On细胞株可用于外源基因的真核调控高表达 ,为研究真核基因功能提供了一种有力的实验手段。

新基因CT120在肺癌组织中的表达及其对细胞生长的影响

背景与目的:基因CT120是我们实验室从染色体17p13.3位点获得的一个细胞膜相关新基因,mRNA水平检测结果表明该基因在人正常肺组织中不表达,但在人肺癌细胞系SPC-A-1中高表达。本研究进一步从蛋白水平研究CT120在肺癌及癌旁组织中的差异表达及CT120异位表达(ectopicexpression)与过表达(overexpression)对细胞生长的影响。方法:用生物信息学方法设计15肽,合成并偶联到大分子载体KLH上制成人工免疫原,制备鸡抗CT120多肽抗体;通过Westernblotting方法检测CT120在不同肿瘤细胞系中的表达;通过免疫组织化学技术比较CT120在肺癌及癌旁组织中的差异表达;通过集落形成试验研究CT120异位表达对NIH/3T3细胞生长的影响;通过生长曲线及裸鼠成瘤试验研究CT120过表达对A549细胞生长的影响。结果:获得有效的鸡抗CT120抗体(IgY);CT120蛋白在不同肿瘤细胞系中表达程度不同,并在不同类型的肺癌组织中高表达;CT120基因异位表达显著促进NIH/3T3细胞的生长;同时CT120过表达对A549细胞在体内体外的生长有促进作用。结论:基因CT120与肺癌的发生发展有关,是一个人肺癌相关新基因。

酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究

目的 分离和克隆肝癌相关基因。方法 我们用高通量功能筛选和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2 (homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)。结果 LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达 ,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1Hs- 1。放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体 1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用 ;另外 ,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用 ,提示该基因可能参与细胞的生长调控。结论 LASS2是一个新的肝癌相关基因。

过氧化物酶体增殖激活性受体γ(PPARγ)在肝癌组织中的差异性表达

目的检测过氧化物酶体增殖激活性受体γ(PPARγ)在肝癌组织中有无差异性表达且有无突变。方法用半定量RT- PCR,Western blot,FISH,PCR-SSCP等方法进行鉴定。结果用半定量RT-PCR检测,有8/14为癌中高表达;Western blot 方法检测,9/15为癌中高表达。免疫组化显示PPARγ在所有的癌旁组织中定位于细胞浆中;而在5个癌组织中定位于细胞核中;突变热点PPARγ外显子3和5在34对肝癌标本中没有突变。结论过氧化物酶体增殖激活性受体γ在肝癌组织中有差异性表达并且在肝癌标本中没有突变。提示PPARγ可能与肝癌的发展有一定的相关性。

集落刺激因子1及其受体的单抗对人肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用

探讨集落刺激因子┐１及其受体在人原发性肝癌中的过量表达及其意义。方法抗ＣＳＦ１Ｒ和抗ＣＳＦ１单克隆抗体对裸鼠移植性人肝癌７７２１细胞的生物学作用。结果两个单抗分别以７４．８８％和７７．９３％的体积抑瘤率在裸鼠体内抑制７７２１细胞的生长。结论ＣＳＦ１Ｒ和ＣＳＦ１可能是一新发现的肝癌自泌和旁泌系统。

ANGPTL4基因对大鼠胶质瘤细胞系C6血管通道形成的影响

目的 研究ANGPTL4基因对C6细胞形成血管通道的影响。方法 将ANGPTL4蛋白进行原核表达 ,用MTT试验观察ANGPTL4对C6细胞增殖的影响 ,用体外迁移试验 ,体外侵袭试验和体外管状形成试验等体外血管新生研究模型观察ANGPTL4基因对C6细胞形成血管通道的影响。结果 ANGPTL4对C6细胞的增殖没有显著性作用 ;ANGPTL4基因可促进C6细胞的体外迁移 ,侵袭和管状形成。结论 ANGPTL4能够促进C6细胞形成血管通道。

人血浆转甲状腺素蛋白的提纯及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:在人原发性肝癌中,转甲状腺素蛋白(transthyretin,TFR)基因转录严重受阻遏.在原发性肝癌患者的血浆中,TTR含量明显降低.因此,有必要从人血浆中提取TTR,观察TIR对人肝癌细胞生长的抑制作用.方法:先用40%饱和硫酸铵,再用5%酚预沉淀人血浆,采用DEAE-Cellulose离子交换层析提取TTR,所提蛋白经蛋白质印迹鉴定并于体外观察TTR对肝癌细胞生长的抑制作用.结果:从血浆中提取的TTR纯度为85%,经蛋白质印迹鉴定正确;体外实验初步证实,TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用.结论:TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,这一性质为生物工程生产TTR,用于临床治疗,提供了可行性依据,从而在蛋白水平进一步证实TTR基因可能是与人肝癌相关的抑癌基因候选者.

人类染色体17p13.3位点新克隆基因HC56、HC71和HC90对Jurkat细胞活力的作用

目的 探讨人类染色体 17p13.3位点新克隆基因HC5 6、HC71和HC90对T淋巴瘤细胞株Ju rkat细胞活力的作用。方法 应用脂质体介导的基因转染方法 ,将外源基因HC5 6、HC71和HC90分别导入Jurkat细胞 ,用苔盼兰拒染试验 ,观察基因的瞬时表达对细胞活力的作用。结果 Jurkat细胞瞬时转染HC5 6和HC71基因后 ,与转染PBK/CMV空载体的实验对照组比较 ,第 2 4、4 8、72和 96h ,细胞的活力明显受抑制 (P <0 .0 1) ;Jurkat细胞瞬时转染HC90基因后 ,仅在第 96h细胞的活力受抑制 (P <0 .0 5 ) ,而第 2 4、4 8和 72h ,未发现细胞的活力受抑制 (P >0 .0 5 )。结论 外源HC5

HBVx转基因小鼠肝组织基因表达谱的微阵列研究

目的 研究乙肝病毒 (HBVx)和黄曲霉毒素(AFB1)在诱发肝癌中的分子机理。方法 用AtlasTM cDNA表达阵列方法比较研究HBVx基因转基因小鼠HBVx基因整合 (+)和 (- )的小鼠肝组织 ,以及转基因小鼠经AFB1一次攻击的肝癌组织的基因表达谱的差异。结果 经HBVx基因整合 (+)的小鼠肝组织的DNA修复基因 ,药物代谢酶基因以及应激反应的效应因子的cDNA基因表达谱显示了明显的变化。实验结果提示出现变异的 30个cDNA基因表达谱中 2 9个 (96 .7% )与X基因的整合相关及 17个 (5 6 .7% )与AFB1的攻击有关。结论 HBV对宿主的感染 ,可能通过改变DNA修复系统和药物代谢酶系统来影响机体对AFB1的致癌敏感性 。

肝癌相关基因HCAP1的定位克隆和初步功能研究

目的 克隆和筛选位于染色体 17p13.3缺失区内的肝癌相关基因。方法 采用定位克隆的策略 ,通过PAC筛库和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法克隆新基因 ;通过多组织膜片Northern杂交分析其组织表达谱 ,Southern杂交分析其在肝癌组织DNA水平上的变化 ,然后通过克隆集落形成实验与MTS法测定细胞生长速度 ,初步筛选其作为肿瘤相关基因的可能性。结果 克隆到一个基因HCAP1(HCC associatedprotein 1,先前又称HC5 6 ) ,GenBank登录号为AF177341。多组织膜片杂交显示该基因在多种组织中表达 ,其中胎盘、肝脏和肌肉中表达较高。Southern杂交结果显示HCAP1基因在肝癌组织中存在缺失 ,比例为 2 5 .3% ;克隆集落形成实验与生长抑制率测定实验初步表明该基因能抑制肝癌细胞株Hep3B细胞的生长 ,抑制率为 31.8%。结论 HCAP1可能与肝癌的发生发展相关 ,是一个新的肝癌相关基因的侯选者。

高血压患者及大鼠线粒体ATPase 6基因的克隆、表达与突变研究

目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法（Differentialhybridization）筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠（SHR）心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR－SSCP和测序，进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase6基因构象改变,8701位碱基由G→A（G8701A），编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；A8708G，编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase6基因8584位碱基突变（G8584A），编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸，这一变化与SHR线粒体ATPase6基因改变相一致。结论：高血压病患者外用血白细胞线粒体ATPase6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义，并可能是高血压病的特异性改变。

复制型HBV转基因小鼠的遗传与繁育研究

本文采用类似系祖建系的方法，对复制型ＨＢＶ转基因小鼠模型的１７、２１、２５三个系列进行了繁育，通过ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交的方法，检测三个系列小鼠尾组织和血清的ＤＮＡ样品，以确定ＨＢＶ基因的整合和复制情况。结果表明，ＨＢＶ基因已稳定地遗传至第五代（Ｆ５），且各世代小鼠血清中都存在ＨＢＶＤＮＡ，此外，整合阳性小鼠的血清中能测出ＨＢＶＤＮＡ的比率很高，Ｆ１代为９４．４４％（１０２／１０８），Ｆ２、Ｆ３代为９５．３１％（６１／６４），故在繁育中可以通过测血清中的ＨＢＶＤＮＡ来确定小鼠是否整合。

11株肝癌细胞系染色体17p13.3和p53基因状况的研究

目的了解１１株肝癌细胞系染色体１７ｐ１３．３区基因组结构和ｐ５３基因状况，为今后更好使用这些细胞株提供信息。方法应用染色体微卫星标志ＰＣＲ扩增，同位素标记，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以及染色体可变数目重复排列序列ＶＮＴＲ标志ＹＮＺ２２的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测各细胞株染色体１７ｐ１３．３区基因组结构和ｐ５３基因状况。结果通过上述检测，获得了１１株肝癌细胞在染色体１７ｐ１３．３区８个位点的结构状况。发现来源于我国上海地区构建的６株细胞系在染色体１７ｐ１３．３区各个位点的结构状况基本一致。ＣＣＬ细胞株在该区的两个位点呈纯合子缺失。上述６株细胞系在染色体１７ｐ１３．１区的ＴＰ５３位点呈杂合子，且微卫星重复序列的大小一致，ＣＣＬ及Ｈｅｐ３Ｂ细胞系在ｐ５３基因外显子５，６，７，８基因组片段有缺失，其它细胞系在该区有正常大小的基因组片段。结论本研究提供了１１株肝癌细胞系在染色体１７ｐ１３．

端粒及端粒酶研究的最新进展

端粒是位于真核细胞染色体末端由重复ＤＮＡ序列和蛋白组成的复合物，它具有保护染色体、介导染色体复制、引导减数分裂时的同源染色体配对和调节细胞衰老等方面的作用。正常体细胞每分裂一代，端粒就会缩短一段，而端粒酶的作用是将一段端粒序列加到端粒末端，从而维持端粒长度。正常体细胞中是没有端粒酶活性的，而在大多数肿瘤细胞中都发现了端粒酶的表达，提示端粒和端粒酶在癌症发生和肿瘤细胞行为中具有重要作用。

乙肝病毒（Adr）全基因组在转基因小鼠体内（HBV）DNA的存在状态

本文用ＰＣＲ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ方法检测了３４只Ｇｏ代２６只转基因小鼠携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为７６％），５１５只Ｇ１代转基因小鼠中２４８只组织中携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为４８％），２５只Ｇ２代转基因小鼠中１８只组织中携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为７２％）．对１０８只尼组织阳性小鼠血清检测，１０２只小鼠血清呈ＨＨＶＤＮＡ阳性。以上结果证明，ＨＢＶＤＮＡ基因已整合小鼠的染色体中。这些转基因小鼠对研究ＨＢＶ病毒的复制与表达，慢性肝炎以及肝癌发生的机理，治疗乙肝药物的筛选等具有十分重要的价值。