稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验证。最终,筛选得到靶向于LSDV ORF61基因的一对qPCR引物;利用pCAGGS-ORF61真核表达质粒,获得标准曲线y=-3.287 5x+47.87,线性相关系数R^(2)=0.998 6,扩增效率达101%;荧光定量PCR特异性、重复性和灵敏性试验结果表明,该引物的特异性高、重复性良好和灵敏度高等优点;该引物的最低检测限为6.71拷贝·μL^(-1),各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。以上结果表明,作者建立特异性LSDV的荧光定量PCR检测方法,为LSD预防和控制提供有效的检测手段。

牛结节性皮肤病病毒ORF123基因缺失重组病毒的构建及增殖能力分析

旨在通过缺失牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF123基因,分析其增殖能力,为LSDV ORF123功能研究奠定基础。本研究利用同源重组,以ORF123基因作为靶标,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,采用融合PCR方法,扩增同源左右臂序列以及EGFP基因表达框,克隆至pUC-19T载体,构建基因缺失转移载体pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒。然后将pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,利用蚀斑、梯度稀释和挑取绿色荧光单克隆细胞筛选纯化重组毒株,并鉴定其遗传稳定性和增殖能力。结果显示,利用EGFP筛选标记,通过多次挑斑筛选纯化获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP。该重组病毒至少在8代细胞传代中能稳定表达绿色荧光蛋白,接种MDBK细胞后绘制一步增殖曲线表明该重组病毒滴度略低于亲本毒株。本研究成功获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP,为LSDV ORF123蛋白生物学功能研究以及减毒活疫苗的研制奠定基础。

应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。

优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响

为了探讨乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量及其pH的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量的动态变化及pH。结果显示,在青贮过程和有氧暴露后,分别添加肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2和发酵乳杆菌E2-3的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组,而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组,pH亦低于对照组。其中B1-7和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多,从青贮第7天开始到有氧暴露的30d内,始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多,好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低。以上结果表明这5株乳酸菌具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。

复合乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后微生物及饲料品质的影响

为探讨不同复合乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中微生物数量及其发酵品质的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的复合乳酸菌接种剂,共设置3个不同组合乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,并设空白对照,测定青贮3、7、15和30 d,开袋有氧暴露1、3、7、15和30 d时微生物数量、发酵品质和营养成分的变化情况。结果表明,分别添加异型乳酸菌组合(Hetero)、同型乳酸菌组合(Homo)和同型+异型乳酸菌组合(Homo+Hetero)的各处理组均能有效地增加青贮过程和有氧暴露后饲料中乳酸菌的数量、乳酸(LA)和乙酸(AA)的含量,减少好氧细菌、酵母菌和霉菌数量,降低pH和氨态氮(NH 3-N)含量,减少粗蛋白(CP)损失,显著改善青贮饲料发酵品质,抑制青贮饲料有氧暴露后的二次发酵,其中Homo+Hetero效果最好,Homo处理组好于Hetero处理组。

蛋白激酶CK2抑制剂对鸡朊蛋白高表达和抑制表达DF-1细胞生物学行为的影响

为探讨CK2在鸡细胞型朊蛋白(ChPrP^C)高表达和抑制表达的DF-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrP^C表达量的关系,以DF-1-PrP和DF-1-SiRNA-3细胞为模型,DF-1细胞为对照,分别用0、25、50、100nmol·L^(-1)米托蒽醌处理以抑制CK2,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因mRNA转录。结果显示,DF-1-PrP、DF-1-SiRNA-3和DF-1细胞的PRNP基因mRNA转录量随着米托蒽醌浓度的增加均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在同一米托蒽醌浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于DF-1细胞,总凋亡率均低于DF-1细胞;DF-1-SiRNA-3细胞则相反。表明ChPrP^C的高表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,而ChPrP^C的低表达则相反;CK2在ChPrP^C介导DF-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中具有重要的作用。本研究结果为进一步阐明ChPrP^C生理功能的分子机制奠定基础。

PI3K/Akt抑制剂对鸡朊蛋白过表达DF-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的DF-1细胞(DF-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以DF-1-PrP细胞为模型,空载体转染的DF-1-NC细胞和DF-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100、200nmol·L-1渥曼青霉素处理以抑制PI3K/Akt信号通路,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因转录量。结果显示,随着渥曼青霉素浓度的增加,DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞的PRNP基因转录量均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在低于100nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于对照组,而总凋亡率均低于对照组。本研究表明ChPrPC的过量表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,在以上过程中,PI3K/Akt信号通路可能具有重要的作用,渥曼青霉素能有效阻断这一通路,但PI3K/Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。

动物医学专业预防兽医学实验Ⅰ教学改革探讨

预防兽医学实验Ⅰ包括兽医微生物学和兽医免疫学实验,这两门课程都是实验性很强的学科,加强实验教学对于培养学生的综合素质和创新能力具有重要意义.本文从优化实验教学条件、改革实验教学内容、改进实验教学模式、规范实验报告格式和构建试验考核体系五个方面,提出了预防兽医学实验Ⅰ教学改革的一些具体措施.

三黄鸡大肠杆菌和沙门氏菌混合感染病原分离鉴定及诊治

对甘肃省榆中2个鸡场饲养的发病三黄鸡进行了流行病学调查、临床症状和病理变化观察、病原菌分离鉴定及血清学诊断,确诊为大肠杆菌与沙门氏菌混合感染。通过药敏试验,选择敏感药物及时治疗,迅速控制了疫情。

青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为筛选优良的青贮饲料添加剂,采用平板分离法从青贮饲料中分离乳酸菌,通过细菌形态学、生理生化特征鉴定和16S rRNA基因序列分析相结合的方法对分离出的细菌进行鉴定。通过产酸性试验和抑菌试验对分离出来的12株乳酸菌进行筛选,并对筛选出的6株乳酸菌进行生物学特性比较。结果显示,5株为戊糖片球菌,4株为植物乳杆菌,1株为发酵乳杆菌,1株为肠系膜明串珠菌肠膜亚种,1株为屎肠球菌;菌株B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1、B5-2的产酸能力和抑菌效果较好;菌株B1-7和B5-2生长最快,8 h后进入稳定期,其余菌株14 h后进入稳定期;菌株B1-7在培养温度高于45℃,培养基pH>10和含盐量>0.08g/mL时不再生长,其余菌株均具有良好的抗逆性具备青贮潜力,可作为秸秆青贮的生物添加剂做进一步研究。

5株乳酸菌复合物与CaCO_3,酶及尿素不同组合对全株玉米青贮品质影响

为探讨前期筛选出的5株对好氧细菌、酵母菌和霉菌具有优良抑菌活性乳酸菌的复合物及其与CaCO_3、酶及尿素不同组合对全株玉米青贮发酵品质及营养成分的影响,进一步筛选优质复合青贮生物制剂,共设置7个不同组合添加物进行全株玉米青贮,并设空白对照组,测定青贮3、10和30 d时其发酵品质和营养成分的变化情况。结果表明,添加5株乳酸菌混合剂有提高全株玉米青贮发酵品质和营养品质的趋势;同时添加CaCO_3和复合乳酸菌能进一步增加青贮饲料的乳酸(LA)和乙酸(AA)产量,尤其是AA产量,防止pH值过分降低,也有提高青贮营养品质的趋势;同时添加尿素和复合乳酸菌能进一步提高青贮的AA和氨态氮的含量,防止pH值过分降低,显著提高粗蛋白(CP)含量,从而提高青贮营养品质;纤维素酶和淀粉酶复合物可以提高发酵产物的水溶性碳水化合物(WSC)含量及LA和AA产量,改善青贮发酵品质;复合CaCO_3、尿素、纤维素酶、淀粉酶和复合乳酸菌的添加对提高全株玉米青贮的发酵品质和营养品质的效果最好;全株玉米青贮发酵品质和营养品质在前3 d变化最快,发酵不同阶段不同添加组合的变化不尽一致。

5株优良抑菌活性乳酸菌对全株玉米青贮品质的影响

为了探讨具有优良抑菌活性的乳酸菌对全株玉米青贮过程不同时期营养品质的影响,进一步验证并筛选出可提高玉米秸秆青贮品质的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多,且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加到全株玉米秸秆中进行青贮,共设置6个试验组,分别在青贮第3、7、15、30天测定产物的干物质(DM)、粗蛋白(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和氨态氮(NH3-N)含量及第30天乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。结果显示,发酵30d后,5个处理组的DM、CP、ADF和LA含量显著高于对照组(P<0.05),NH3-N和WSC含量显著低于对照组(P<0.05),B3-1组NDF显著高于对照组(P<0.05),但与其他处理组差异不显著(P>0.05),B3-1和B5-2组AA含量显著高于对照组(P<0.05),但与其他处理组差异不显著(P>0.05);各组DM、CP、WSC含量均随发酵时间延长而降低,而ADF、NDF和NH_3-N含量均随发酵时间的延长而升高;B3-1组在玉米秸秆全株青贮发酵各期的发酵品质和营养品质最优。以上结果表明5株乳酸菌均能显著改善青贮饲料发酵品质,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。

产纤维素酶真菌菌株的分离筛选及产酶条件优化

【目的】由于真菌的纤维素酶系较全,且可分泌至胞外,易分离,所以试验致力于筛选高产纤维素酶真菌菌株.【方法】利用羧甲基纤维素钠培养法、刚果红染色法、纤维素酶活性测定法从样品中分离筛选出产纤维素酶菌株,同时结合菌落形态观察、显微镜观察和ITS序列同源性分析进行鉴定.【结果】通过初筛,筛选出15株Hc值较大的产纤维素酶真菌菌株,再经过液体发酵复测羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活,筛选出一株产纤维素酶活最高的菌株B-2-3,经鉴定B-2-3为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）,其羧甲基纤维素酶活为2 341.76U/mL,滤纸酶活为398.18U/mL.经过产酶条件优化,确定其最适产酶条件为温度25℃、接种量4μL、蛋白胨0.5~0.6g/L、CMCNa 0.3~0.35g/L、pH 6.5.【结论】筛选出一株产纤维素酶活较高的烟曲霉菌株B-2-3.

产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定。结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P<0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。

TMR中添加牛至精油抑菌作用的研究

在全混合日粮(TMR)中添加抗生素可以解决其变质问题,然而动物长期使用抗生素会产生药物残留等问题。牛至精油是一种天然无化学毒害且具有强抗菌作用的植物精油,可作为饲料添加剂。为研究牛至精油对TMR中霉菌、细菌、大肠菌群的抑制作用,并分析p H和温度对牛至精油抑菌作用的影响,将牛至精油添加到荷斯坦奶牛(约650 kg)的TMR中,采用平板菌落计数法检测TMR中霉菌、细菌的菌落数;采用国标乳糖胆盐发酵法检测大肠菌群的最可能数。结果表明:牛至精油对TMR中的霉菌、细菌、大肠菌群均有抑制作用且差异显著(P<0.05),可作为饲料添加剂提高TMR的新鲜度。

朊蛋白在癌症发生中的作用

正常细胞型朊蛋白(PrPC)是一种高度保守、在所有哺乳动物体内广泛表达的细胞表面糖蛋白,人类PrPC在胚胎发育早期即已表达。研究表明,PrP在多种癌症中表达,包括胃癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌(HCC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)等,影响这些癌症的发生与侵袭,并在多药耐性(MDR)获得中起重要作用。因此,朊蛋白有望成为治疗多种癌症的新靶标。论文就PrP的结构、功能及其在细胞功能和疾病发生发展中的作用,以及PrP在多种肿瘤发生发展、耐药性的作用等研究进行概述,并对PrP在癌症新型疗法未来发展中的潜在影响进行分析讨论,以期为PrP相关肿瘤病的防治方面做出贡献。

马立克氏病鸡组织中PRNP基因表达量分析

【目的】探明PRNP基因表达量与鸡马立克氏病发病之间的关系.【方法】从甘肃省康乐县某养鸡场采集马立克(MD)病鸡组织样品,通过RT-PCR检测MDV致瘤相关基因Meq和pp38以及病理组织学观察将样品分为MD肿瘤病变鸡、MD无病变鸡与健康鸡,最后通过荧光定量PCR方法分析3组中PRNP基因mRNA水平的相对表达量的差异.【结果】MD无病变鸡中PRNP基因的表达规律与健康鸡基本一致,但与MD肿瘤病变鸡完全不同;除脑外,MD病鸡组织PRNP基因的表达量均高于健康鸡,其中肿瘤病变组织PRNP基因的表达量显著高于无病变组织(P<0.05),而且PRNP基因在MD病鸡肿瘤病变组织与健康鸡组织的表达差异与肿瘤病变程度有关.【结论】PRNP基因的表达量与MDV感染存在相关性,PRNP基因在MD肿瘤组织中过表达,且PRNP基因的差异表达与肿瘤病变程度有关.

牛源粪肠球菌人工感染BALB/c雌鼠肾脏组织过程中PRNP和PRND的表达变化研究

为了研究牛源粪肠球菌感染对小鼠PRNP和PRND基因表达水平的影响,用牛源粪肠球菌感染小鼠,在1~7 d内解剖小鼠,制作病理组织革兰氏染色及石蜡切片HE染色,最后通过荧光定量PCR检测感染后1~7 d内PRNP和PRND的表达情况。结果表明:牛源粪肠球菌感染BALB/c雌鼠后,肾脏组织病变较明显,实时荧光定量检测确实对PRNP和PRND基因的表达量存在影响;球菌感染PRNP和PRND基因在每个时段的表达量均高于空白对照组。说明小鼠肾脏的PRNP和PRND基因的表达水平随着感染时间的改变而发生变化。