单种群菌落分形结构的形成及其机制研究

在变形杆菌、绿脓杆菌单种群菌落分形结构的形成过程中，细菌的运动、潜－生序变化及环境的营养水平是菌落形成扩散限制聚合模型（ＤＬＡ）分数维图样的关键。

潜生体定植的原位观察技术研究

对小鼠结肠组织原位标本进行潜生体定植的实验研究。染色采用美蓝初染后 ,高锰酸钾复染的方法。方法简便。

形态受培养温度影响的绿脓杆菌菌株

从临床分离的一株绿脓杆菌表现出特殊性状，该菌在３７℃培养时保持正常的短杆状，在２５℃ 培养过夜则形成丝状形态，且不产生绿脓色素。当延长培养时间至７２ｈ以上或提高培养温度至３７℃， 则丝状体开始逐渐断裂形成正常的短杆状菌体，并出现绿脓色素。初步研究表明，该现象与营养条件 无关，菌群的生长密度可以影响这一现象，紫外线的照射有促进作用，同时绿脓色素的缺失不是丝状 体形成的原因。

不同生长形态绿脓杆菌胞外粘液多糖的含量及其意义

目的 探讨不同形态绿脓杆菌胞外粘多糖的含量及其对体外培养的肺癌细胞粘附能力的影响。方法 在分离一株形态对培养温度敏感的绿脓杆菌基础上 ,提取潜生体与繁殖体的胞外粘液多糖 ,以干重比评价二者粘液多糖的含量 ;并测定其对体外培养细胞粘附的影响。结果 潜生体胞外粘液多糖含量显著增加 (P <0 .0 1) ,同时其对体外培养细胞的粘附率也显著提高 (P <0 .0 1)。结论 绿脓杆菌繁殖体转变为潜生体后 ,其胞外粘液多糖含量及其粘附能力均有显著性提高。对绿脓杆菌潜生体的研究有助于对绿脓杆菌致病性的深入认识。

利用Mini-Tn5转座子诱导弗氏枸橼酸杆菌插入突变的研究

目的 研究以自杀性质粒pUT携带的Mini Tn5转座子对弗氏枸橼酸杆菌进行转座诱变。方法 转座采用双亲本接合法 ,对获得的接合子进行无抗性选择条件下的连续传代测定其稳定性 ,并测其氨苄青霉素耐性及进行质粒提取以排除质粒传代原因造成假阳性的可能。对接合子进行营养缺陷株和运动突变株的筛选。结果 Mini Tn5Km转座率约为每受体菌 9 2× 10 - 6 ,接合子在无抗性选择的情况下培养 3代仍保持稳定 ,卡那霉素抗性不消失 ,说明插入到染色体上的转座序列是稳定传代的。接合子的抗性是染色体而非质粒编码的结果。对营养缺陷株的筛选和分析提示 ,转座子的插入是随机的 ,弗氏枸橼酸杆菌染色体中无明显的转座插入热区。使用该转座子能有效筛出运动突变株。结论 Mini Tn5系列转座子适于大规模筛选弗氏枸橼酸杆菌突变株。

结核分枝杆菌PstS1-U1融合抗原的表达、纯化及其免疫活性测定

目的为获得一种适于本地结核病临床诊断用抗原,将结核分枝杆菌38×103抗原——即磷酸盐传送蛋白1(phosphate transport system protein l,PstS1)和尿蛋白1(urine protein1,U1)进行融合表达、纯化并测定其抗原活性。方法用基因拼接法将结核分枝杆菌编码PstS1和U1蛋白的基因拼接在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导实现其高效表达,采用亲和层析纯化表达产物。用纯化的融合抗原免疫家兔获得抗血清,用该血清以及活动性肺结核患者血清对纯化产物的抗原活性进行测定。结果成功构建了原核表达质粒,对表达产物进行亲和层析纯化,获得相对分子质量为57×103的目的蛋白。经Western blot检测融合抗原能够与活动性肺结核患者血清中的抗体发生结合。结论本研究表达并纯化出PstS1-U1融合抗原,为进一步的应用奠定基础。

宏基因组学:基本策略及在医学研究领域中的可能应用

宏基因组学(metagenomics)的提出是分子生物学领域的一个重要进展。在自然生境中有大量不可培养微生物的存在,无法通过培养法进行研究,而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。宏基因组学是从生境中取得全部微生物的基因组,并进行系统研究的方法。该文介绍宏基因组学的基本情况,并着重探讨其在医学研究领域中的可能应用。

弗氏枸橼酸杆菌脂多糖突变株发生鞭毛合成异常

目的探讨弗氏枸橼酸杆菌群集运动的分子机制。方法用M in i-Tn5 Km转座子诱导获得弗氏枸橼酸杆菌群集运动突变株;通过反向PCR扩增突变基因并测序,从而确定发生突变的基因;观察突变株的运动和形态等特征。结果研究表明有7株突变株涉及3个与脂多糖合成有关的基因突变,分别为wzxB、waaW、waaL,导致弗氏枸橼酸杆菌群集运动能力显著下降。同时,这些突变株的鞭毛合成也出现异常,即培养的细菌中仅有小部分呈现正常的鞭毛合成,而大多数菌体聚集在一起,且鞭毛合成呈抑制状态,电镜观察发现多数聚集的菌体没有鞭毛或只有很少的鞭毛。与之相对应的是,野生株没有这个现象。结论脂多糖结构的缺失影响弗氏枸橼酸杆菌鞭毛的生成,进而影响其群集运动能力。

铜绿假单胞菌XQ17提取物对革兰阳性菌的拮抗作用

从临床分离的1株铜绿假单胞菌能够产生拮抗物质,对其粗提物的初步研究表明,能有效杀灭受试的多数革兰阳性菌。通过比较其基本特征,与已知的铜绿假单胞菌产生的其他抗菌物质如Pyocyanin、Phenazine-1-carboxamide、Pseudomonic acid、pyocin等有明显区别,提示可能是一种具有潜在应用价值的新抗菌物质。

多媒体教学中几个问题的思考

多媒体技术所具备的卓越能力,使其成为备受推崇的现代教育手段。然而多媒体教学也有一定的局限性,本文针对多媒体教学中常见的几个问题提出了自己的思考和见解。

细菌复苏促进因子──Rpf

细菌复苏促进因子Rpf是第一个被发现的原核生物自分泌生长因子,该因子在放线菌门细菌中广泛存在,具有促进细菌休眠体复苏的作用。Rpf在细菌生长代谢过程中所发挥的重要调节作用,使其具有潜在的应用价值。

利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法

构建细菌突变株是认识细菌基因功能的一个重要途径。如果针对某个细菌建立一个包括所有基因的单基因突变株库,对于该细菌基因功能的认识无疑具有巨大的推动作用。本文综述了利用转座子建立细菌突变株库的工作,并侧重于其构建策略和方法。

根据人体生物钟改进临床微生物学的教学方法

节律性是生命的基本特征。越来越多的证据表明,人体生理存在着广泛的节律性,其中研究最广泛的就是睡眠——觉醒节律。成年人一般为单相性或双相性睡眠(即24小时中有一到两次睡眠)。而实际上,在觉醒状态下,仍然存在着朦胧(弱反应、弱记忆状态)——清醒大约20分钟交替一次的节律。不过,这个节律没有睡眠——觉醒节律那么明显,因为白天当处于外界多种信号刺激下,大脑兴奋点较多时。

嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达

嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的异源二聚体β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶2家族,由两个部分重叠、协同翻译的基因编码(lacL和lacM)。【目的】克隆表达该酶并测定其酶学特性。【方法】参照已全基因组测序的嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株基因组为模板,将lacL的RBS到lacM的终止子之间的序列(2834bp)克隆到pQE31质粒上,并电转化JM109菌株。以下列步骤纯化表达产物:硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻层析。以凝胶排阻层析测定纯化酶的天然分子量,以邻硝基苯基半乳糖为底物测定其酶学特性。【结果】实现了该酶在JM109菌株中的可溶性表达。其氨基酸序列有一处不同于嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,即其大亚基(LacL)的第512位氨基酸不是组氨酸而是精氨酸。纯化酶比活力为226U/mg蛋白,天然分子量为96.3±4.6kDa,最适pH为7,最适温度为49℃,Km和Vmax值分别是:2.18±0.12mmol/L,273±5U/mg蛋白。

嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化

目的分离纯化嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356的3-磷酸甘油醛脱氢酶。方法利用硫酸铵分级沉淀法、亲和层析、阴离子交换和分子筛层析对嗜酸乳杆菌GAPDH进行了分离纯化。通过N端测序鉴定了纯化产物;并用分子筛测定了嗜酸乳杆菌GAPDH的相对分子质量(Mr)。结果纯化产物在SDS-PAGE胶上呈现Mr为3.7×104的单一条带,产量为0.9 mg/L(嗜酸乳杆菌培养物)。N端测序结果证明纯化产物为嗜酸乳杆菌GAPDH。分子筛测定的GAPDH的Mr为7.08×104,表明嗜酸乳杆菌GAPDH是二聚体。结论通过该纯化方案,可大量获得电泳纯的嗜酸乳杆菌GAPDH,为进一步研究其免疫功能以及开发为免疫促进剂打下了基础。

革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点oriR6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段。载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用。

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶谱电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性。结果酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。结论该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。