仿刺参水溶性海参皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究

利用海洋生物资源进行天然抗真菌新药的开发，从冻干海参加工废液中提取了水溶性海参皂苷，并对其抗真菌活性进行了研究。采用大孔吸附树脂法提取水溶性海参皂苷，经Libermann Burchard反应等对提取物的性质进行鉴定后，利用管碟法对所得提取物的抗菌活性进行了测定，并利用琼脂稀释法测定了所得水溶性海参皂苷对6株供试真菌的最低抑菌浓度（MIC）。提取物在Molish反应、沉淀反应和泡沫实验中均为阳性，说明提取物中确含有皂苷类成分；在Libermann Burchard反应中，液体的颜色处在红色与紫色之间，显示提取物可能是1种三萜类皂苷。水溶性海参皂苷对6株供试真菌均具有显著的抑制作用，且在浓度为0．5～4mg／mL的范围内，其抑菌活性与所用浓度之间呈明显的正相关性；在浓度为4mg／mL时，水溶性海参皂苷对6株供试真菌抑制活性的大小依次为裂殖酵母菌、啤酒酵母菌、白色念珠菌、葡萄炭疽病原菌、黄瓜枯萎病原菌和黑曲霉，海参皂苷对6株真菌的MIC值依次分别为0．002，0．016，0．063，0．063，0．125．0．250mg／mL。

高校科技成果产业化中间环节的作用、构建及运行

研究了作为科技成果产业化中间环节 :技术研究开发和中试阶段工作的意义和作用 ,通过实例讨论中间环节的构建和运行 ,并提出相关建议。

几种免疫促进剂对中国对虾血细胞数量、形态结构以及酚氧化酶产量和活性的影响

为了弄清免疫促进剂增强对虾自身免疫力的作用机理,利用脂多糖(LPS)、β 葡聚糖(β 1,3 glucan)、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌对中国对虾血细胞的数量、形态结构以及酚氧化酶(phenoloxidase,PO)的产量与活性在刺激前后的变化进行了研究。研究结果表明,经β 葡聚糖、脂多糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌刺激后,中国对虾总血细胞的数量分别增多了83.4%、52.0%、73.4%和111.3%,其中,小颗粒细胞的数量分别增多了100.4%、67.3%、57.2%和102.9%,大颗粒细胞的数量分别增多了47%、10%、127%、和173%;同时,PO的产量分别提高了81.3%、104.7%、29.2%和40.4%,但PO的单位酶活性在刺激前后没有显著变化。透射电镜(TEM)观察结果显示,中国对虾血细胞的超微结构在免疫刺激前后发生了不同程度的变化。在β 葡聚糖和脂多糖刺激下,小颗粒细胞和大颗粒细胞内糙面内质网(RER)和游离核糖体数量明显增多,线粒体数量增加,细胞内分泌颗粒的数量大幅度减少;而透明细胞的超微结构在多糖刺激前后除RER及线粒体数量略有增加、核孔复合体数量明显增加外没有显著差异。经灭活哈维氏弧菌刺激后,对虾大颗粒细胞中RER增生显著并发生泡状化,核质比明显降低;小颗粒细胞中的RER也发生增生且呈泡状化,核质比略有降低;透明细胞中RER数量明显增加,

大菱鲆鳍细胞系的建立

建立大菱鲆（Scophthalus maximus）鳍细胞系,文中采用胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法启动大菱鲆鳍组织的原代培养,并通过培养液配方和培养条件的优化成功进行大菱鲆鳍细胞的继代培养。研究结果显示,在pH=7.0-7.4、温度20-24℃的培养条件下,培养于含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐的Leibovitz-15培养液（20%胎牛血清）中的大菱鲆鳍细胞,其生长分裂状况最好,细胞形态为成纤维细胞样。经继代培养后,细胞生长分裂依然十分旺盛,第60代大菱鲆鳍细胞系的群体倍增时间为62.4 h,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体仍为44条。该细胞系细胞经液氮冻存后仍保持有原有形态和较高存活率。现已成功建立了连续性大菱鲆鳍细胞系,目前已传至第65代。该细胞系的建立对于查清病毒对大菱鲆细胞的感染途径与感染机理等具有重要的理论意义,对于病毒疫苗研制具有重要应用价值。

水溶性海参皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

从冻干仿刺参加工废弃液中分离纯化出水溶性海参皂苷,筛选并纯化出其强抗真菌活性组分,为利用水溶性海参皂苷研制高效抗真菌药物创造条件.先后利用大孔树脂柱层析和硅胶柱层析对水溶性海参皂苷进行了纯化,并对各种纯化组分的抗真菌活性进行了测定.在30%,50%,70%,80%,95%乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中,70%乙醇溶液洗脱组分对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抗真菌活性最强.70%乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后,得到了SC-1、SC-2、SC-3和SC-4四种纯化样品,除SC-1无抗真菌活性外,其它3种纯化样品对裂殖酵母菌和白色念珠菌均具有显著的抗真菌活性,且组分SC-2和SC-3的抗真菌活性高于SC-4.SC-2纯化样品在高压液相柱层析(HPLC)图谱中仅显示为单一洗脱峰,且在旋转蒸发后可形成结晶,表明其纯度极高,可用于高效抗真菌药物的研制.

羧甲基壳多糖毒理学研究

羧甲基壳多糖的毒理学研究,包括急性皮肤毒性、急性经口毒性、长期经口毒性。研究结果表明羧甲基壳多糖属安全无毒物质。对小白鼠急性皮肤毒性LD_(50)>2200mg/kg,急性经口毒性LD_(50)>5001mg/kg长期经口毒性实验,采用高、中、低3个剂量组,对大白鼠体重增长百分率、血象、内脏外观、肝肾功能及肝、肾组织学检查,均未发现异常。

水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

为了分离纯化出具有强抗真菌活性的水溶性海星皂苷,以罗氏海盘车(Asterias rollestoni)腕为实验材料,利用水抽提方法获得水溶性海星皂苷粗品,依次利用大孔树脂和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了纯化,并对其抗真菌活性进行了测定。研究结果发现,在30%、50%、70%、80%、95%乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中,70%乙醇溶液洗脱组分对白色念珠菌和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。70%乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后,得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四种纯化样品,其中SF-1纯化样品没有抗真菌活性,SF-2纯化样品具有极弱的抗真菌活性,SF-3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。SF-3纯化样品在高压液相柱层析(HPLC)图谱中仅显示单一洗脱峰,表明其纯度很高,可应用于高效抗真菌药物的研制。研究结果为利用水溶性海星皂苷研制高效抗真菌药物奠定了基础。

短蛸血细胞的形态结构、类型、细胞化学特性及其吞噬活性研究

血细胞作为免疫防御的第一道防线,在软体动物的非特异性免疫系统中具有重要作用.为了揭示头足类动物血细胞的形态结构、生物学性质及其免疫学功能,实验利用活体染色、细胞化学和电镜技术等对短蛸血细胞的形态结构、类型、细胞化学性质及其弧菌吞噬活性进行了研究.研究结果显示:短蛸血细胞具有大透明细胞、小透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞4种类型.大透明细胞约占血细胞总数22.6%,平均直径为11.64±0.82μm,胞质中没有或仅含有很少量的颗粒,细胞表面光滑无伪足伸出;小透明细胞约占血细胞总数的1.7%,平均直径为8.88±0.88μm,胞质中仅含有少量颗粒,细胞核对台盼蓝呈阳性反应,核质比较大;小颗粒细胞约占血细胞总数的50.7%,平均直径为12.82±1.54μm,胞质中具有许多大小较为均一的嗜碱性小颗粒,有些细胞内还含有小空泡,不为中性红所着色,疑为颗粒脱内容物所致,细胞表面有较短伪足伸出;大颗粒细胞约占血细胞总数的25.20%,平均直径为13.66±1.50μm,胞质中具有大小不匀的许多嗜碱性颗粒,有些细胞内也含有不为中性红所着色的较大空泡,细胞表面有许多长伪足伸出.颗粒细胞中所含有的大量嗜碱性颗粒可能与蛋白质等分泌物的活跃合成有关.大颗粒细胞还具有全质分泌的特性,小透明细胞极可能是大颗粒细胞全质分泌后的一时性残余胞体.弧菌吞噬实验结果表明,两类透明细胞均没有弧菌吞噬活性,两类颗粒细胞均具有弧菌吞噬活性,暗示这两种颗粒细胞很可能是短蛸发挥细胞免疫功能的关键性细胞,不仅与某些物质的活跃合成与分泌有关,而且可能还直接参与了外来病原的吞噬及清除.研究结果为揭示短蛸血细胞在非特异性免疫防御中的作用奠定了基础,对于丰富软体动物免疫学也具有重要的科学价值.

大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。

组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。

体外重建组织工程人角膜内皮在新西兰兔角膜内皮移植中的应用

目的:验证体外重建组织工程人角膜内皮(TE-HCE)在角膜内皮移植中的作用。方法:以非转染人角膜内皮细胞(HCE细胞)为种子细胞,以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TE-HCE,经CM-DiI标记后对撕除内皮层和后弹力层(DM)的新西兰兔进行了兔穿透性角膜内皮移植。用裂隙灯显微镜观察移植眼角膜的透明度。用荧光显微镜观察种子细胞荧光标记。用茜素红染色和冰冻切片HE染色和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与DM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞、DM和角膜的超微结构。结果:TE-HCE可使新西兰兔角膜保持透明39d以上。角膜内皮层移植区的细胞均带有CM-DiI荧光标记。绝大多数种子细胞为六角形,细胞间连接紧密,重建出了完整的角膜内皮层,且内皮层与DM结合紧密。种子细胞重建出了连续的角膜内皮层,种子细胞、DM和角膜的形态结构与正常对照眼的几乎相同。结论:移植后的TE-HCE在种子细胞形态、连续单层状态、细胞连接形成及超微结构上均与对照兔眼的角膜内皮类似,使移植新西兰兔角膜长期保持透明。

四种免疫促进剂对日本蟳酚氧化酶和血细胞的影响

为查清免疫促进剂对日本蟳(Charybdis japonica)(俗称石蟹)自身免疫力的增强作用及机理,对脂多糖(LPS)、β-葡聚糖(-β1,3-glucan)、灭活鳗弧菌和灭活哈维氏弧菌对日本蟳酚氧化酶(PO)的产量与活性以及血细胞的数量与超微结构的影响进行了研究。结果表明,经4种免疫促进剂处理后,日本PO产量和总酶活性都有显著增加,但PO的比活性与对照相比没有显著差异。日本蟳血细胞超微结构观察显示,多糖处理组小颗粒细胞和大颗粒细胞的糙面内质网和线粒体数量增加,颗粒数量减少、体积增大,而透明细胞的超微结构没有显著变化;灭活弧菌处理组小颗粒细胞中的颗粒数量明显减少,透明细胞中线粒体的数量显著增加。由此可见,多糖类和灭活弧菌类免疫促进剂对日本非特异性免疫系统的影响不同,多糖类免疫促进剂主要提高酚氧化酶原激活组分PO的产量,进而提高PO总酶活性,而灭活弧菌类免疫促进剂主要提高透明细胞和小颗粒细胞的吞噬活性。

日本酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,从日本(Charybdis japonica)血淋巴中分离纯化出了酚氧化酶,并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)作为特异性底物对其生化性质和酶性质进行了研究。结果表明,酚氧化酶和酚氧化酶原的分子质量分别为64.5 ku和69.5 ku。以L-DOPA为底物对酚氧化酶纯品进行研究发现,其最适pH值为6.0、最适温度为40℃。对底物L-DOPA和儿茶酚的米氏常数Km值分别为3.41和7.97 mmol/L。该酶对亚硫酸钠、苯硫脲极为敏感,对硫脲、苯甲酸非常敏感,表明该酶很可能是一种儿茶酚酶型的酶。此外,EDTA,DETC,Zn2+,Mg2+和Cu2+均能显著抑制该酶活性,且10 mmol/L Cu2+能有效地回复该酶被DETC所抑制的酶活性,表明该酶确为一种Cu-金属酶。

宽纹虎鲨软骨细胞体外培养的启动

以活体宽纹虎鲨(Heterodortusjaponicus)的鳃软骨和鳍软骨组织为材料,利用透明质酸酶(hyaluronidase)、Ⅱ型胶原酶(type Ⅱ collagenase)和胰蛋白酶(trypsin)进行消化获得游离软骨细胞,对所得游离细胞连同软骨组织分别用含20%小牛血清的MEM培养液进行体外培养.对软骨细胞体外培养条件的优化结果显示,宽纹虎鲨鳍软骨细胞体外培养的最适pH为7.2～7.6、最佳温度为24℃,成纤维细胞生长因子(bFGF,basic fibroblast growth factor)对软骨细胞作用不显著.培养于pH 7.2～7.6的MEM培养液(含20%小牛血清)中的宽纹虎鲨鳍软骨组织,在24℃启动培养3d后便有软骨细胞开始陆续从组织中迁出,新迁出细胞的形态多为圆形,随着培养时间的延长,部分细胞形态逐渐转变成上皮样.

牙鲆孵化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用凝胶过滤柱层析和阴离子交换柱层析技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎孵化液中分离纯化出了大小约为34.8ku的牙鲆孵化酶。该酶卵膜裂解的最适反应温度为35℃,最适pH为7.0;对底物酪蛋白的米氏常数Km值为1.53mmol/L。该酶对丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的特异性抑制剂非常敏感,而对其他蛋白酶抑制剂不敏感,表明该酶极可能是一种丝氨酸蛋白酶类型的胰蛋白酶。此外,该酶可浓度依赖性地被EDTA所抑制,被Cu2+所强烈抑制,被Ca2+和Mg2+所激活,对Zn2+则不敏感,表明该酶很可能是一种金属蛋白酶。

海星生物活性物质研究进展

海星中含有蛋白、酶、甾类糖苷、神经节苷酯、生物碱等生物活性物质。在海星中已分离纯化出的物质具有多种生理活性。在这些提取物中,蛋白具有免疫活性,促细胞生长活性;甾类糖苷有细胞毒性、溶血、抗病毒、抗炎症、鱼毒素等活性;神经节苷酯类有抗肿瘤活性;生物碱类有细胞毒性、抗病毒、抗真菌活性。

罗氏海盘车腕再生过程的组织学研究

对海盘车腕再生过程的研究,对于早日揭示棘皮动物等后口动物的再生机理具有重要意义。为了查清棘皮动物的再生方式及其机理,文中利用断腕创伤手术、组织化学和细胞化学技术对罗氏海盘车腕的再生过程进行了研究。连续跟踪研究结果表明,创伤8d后,在罗氏海盘车创伤腕的外表皮层和体腔上皮中均出现了干细胞原基样结构(blastemalikestructure)。创伤腕的伤口愈合过程是1个多事件同期发生的综合过程,首先是真皮层中脱分化的肌肉样细胞向创伤处迁移和聚集,经再分化和组织重排逐渐形成成熟的真皮层组织,然后是外表皮层和体腔上皮中的脱分化细胞向创伤处迁移分别形成明显加厚的前表皮层和前体腔上皮,最后再分别分化为成熟的表皮层和体腔上皮。而海盘车腕的再生过程则包括新生腕芽的延长和残腕的延长2个事件同期发生的过程。新生腕芽的生长与延长是在创伤愈合的基础上,依靠表皮层、体腔上皮和真皮层来源的脱分化细胞的迁移和再分化先形成新生腕芽,随后在新生腕芽上又出现了新的干细胞原基样结构,使腕芽逐渐生长和延长。而创伤刺激下残腕的延长,则是在形成干细胞原基样结构的基础上,在残腔体壁的许多部位形成多个横跨体壁的“楔状”干细胞原基样结构,这些结构的多点插入及其再分化形成新的体壁组织使残腕得以延长。本文的研究结果还显示,罗氏海盘车腕的再生同时采用了表变态再生和变形再生2种方式。

中国对虾淋巴器官中球形病毒的电镜观察

应用光镜和电镜对中国对虾淋巴器官的显微结构和超微结构进行观察，结果表 明，淋巴器官的盲管主要由内皮细胞和基质细胞构成，细胞间隙内充满着大量的以颗粒细 胞为主的血细胞；在淋巴样细胞中发现有球形病毒感染，其直径７０～１００ｎｍ，有被膜，包涵 体多数为球形，外无囊膜，被感染的细胞有明显的病理变化，主要表现为核膜局部扩张，部 分破裂，高尔基器与内质网轻度水肿，以及线粒体内嵴的溶解。同时发现在细胞内有支原体 共同感染现象。

中国红豆杉细胞紫杉醇合成期特异表达新基因TS1-FL的部分cDNA克隆

采用mRNA差异显示技术(DDRT PCR)比较了悬浮培养的中国红豆杉细胞合成紫杉醇前后的基因表达差异,并从紫杉醇合成期细胞中分离出一个特异表达的cDNA克隆TS1.TS1长度为638bp,序列相似性分析结果表明它代表一新基因序列(Genbank登录号:AF426429),将此新基因命名为TS1 FL.开放读框分析结果表明TS1拥有一个不完整的开放读框,蛋白质同源性检索没有发现与TS1翻译序列有较大同源性的蛋白质.对此基因的进一步研究可揭示它在紫杉醇生物合成中所扮演的角色.