维吾尔族与汉族假性剥脱综合征性白内障患者房水蛋白质组学分析

目的:分析维吾尔族与汉族假性剥脱综合征性白内障(PXEC)患者房水蛋白质表达差异。方法:分别收取2020年6月至2021年1月在和田地区人民医院拟手术治疗的新疆维吾尔族PXEC患者(U组)与天津医科大学眼科医院拟手术治疗的汉族PXEC患者(H组)房水样本各6例,采用非标记定量蛋白质组学技术对两组房水中的蛋白进行鉴定和定量分析,筛选出差异蛋白并通过基因本体(GO)功能分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析两组患者房水中差异蛋白的功能及调控的信号通路。利用STRING数据库建立蛋白-蛋白互作(PPI)网络,使用Cytoscape软件中MCODE插件识别PPI中的枢纽蛋白。结果:本次研究共鉴定出629个蛋白。以差异倍数>2且P<0.05为标准共筛选出123种差异表达蛋白,与H组相比,U组下调蛋白92种,上调蛋白31种。GO分析和KEGG分析发现,这些差异蛋白主要集中在补体及凝血级联通路、细胞外基质受体相互作用通路、系统性红斑狼疮通路、焦点黏附通路、阿米巴病通路、血小板激活通路、溶酶体通路、胆固醇代谢通路和多种类型的N-聚糖生物合成等通路。通过PPI筛选出17种枢纽蛋白,其中包括纤维连接蛋白(FN1)、载脂蛋白E(ApoE)、淀粉样β蛋白前体(APP)、玻连蛋白(VTN)、簇集蛋白(CLU)、载脂蛋白A-Ⅳ(ApoA4)、补体C4A(C4A)、补体C4B(C4B)、凝血因子12(F12)、纤维蛋白原α链(FGA)、纤维蛋白原β链(FGB)、纤维蛋白原γ链(FGG)、激肽原-1(KING1)、富组氨酸糖蛋白(HRG)、补体C8A(C8A)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)与肝素辅因子2(SERPIND1),MCODE分数为12.375。结论:ApoA4、FGA、FGB、FGG等17种枢纽蛋白主要涉及补体及凝血级联通路与胆固醇代谢通路,提示两民族在胆固醇代谢与炎症调节方面存在生物学差异。

剥脱综合征患者房水蛋白质组学分析

目的分析剥脱综合征(XFS)患者房水蛋白质的表达差异。方法收集2020年6月至2021年1月在和田地区人民医院拟行手术治疗的维吾尔族年龄相关性白内障患者和XFS伴白内障患者各10例,分别作为白内障组和XFS组。术中借助超声乳化手术通道吸取前房中部50~100μl房水。通过非标记定量蛋白质组学质谱分析技术对房水中提取的蛋白进行分析,以白内障组作为对照组,并根据P<0.05、差异倍数>1.5的标准筛选得到XFS组的差异表达蛋白。通过基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析来探讨XFS组差异表达蛋白的功能及调控信号通路。结果与白内障组相比,XFS组共鉴定出25个差异表达蛋白,这些蛋白主要涉及细胞黏附、受体、水解酶、分子运输等。表达下调的蛋白有14个,包括补体H因子相关蛋白1(CFHR1)、内质网分子伴侣BiP(HSPA5)、双糖链蛋白多糖(BGN)、FRAS1相关的细胞外基质蛋白2(FREM2)、血红蛋白亚基δ(HBD)、血红蛋白亚单位γ1(HBG1)、棕榈酰蛋白水解酶2(PPT2)等。表达上调的蛋白有11个,包括转化生长因子结合蛋白2(LTBP2)、极低密度脂蛋白受体、层粘连蛋白亚基α2(LAMA2)、凝血因子Ⅸ(F9)等。其中,FREM2为XFS组差异表达最显著的蛋白,其在XFS组个体样本中表达水平基本一致。GO分析显示,这些差异蛋白主要定位于胶原蛋白的细胞外基质、结合珠蛋白-血红蛋白复合物、血浆脂蛋白颗粒和溶酶体腔;分子功能和生物学过程显示,HBD和HBG1参与细胞解毒过程,PPT2参与水解酶活性,BGN和LTBP2参与糖胺聚糖结合。KEGG信号通路分析显示,CFHR1和F9参与补体和凝血级联通路;FREM2和LAMA2参与细胞外基质相互作用通路。结论XFS的进展可能与细胞外基质蛋白的改变、血-房水屏障破坏以及潜在的炎症反应有关。显著下调的FREM2可能作为XFS潜在的生物学标志物。

新型转录共激活因子人类p100蛋白的抗体制备

目的:制备抗p100蛋白的特异性抗体。方法:利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的方法纯化人类p100蛋白Tudor片段作为抗原,经免疫动物获得多克隆抗血清,并利用Westernblot的方法检测抗体的特异性。结果:获得的抗p100蛋白抗体,经体内和体外试验验证的确可与其相应抗原特异性结合。结论:制备的抗p100蛋白的抗体通过与其抗原即人类p100蛋白在体内和体外试验中的特异性结合,为进一步探讨生理条件下p100蛋白在细胞内信号传导通路的作用提供了可靠工具。

IL-6、IL-8上调卵巢癌细胞雄激素受体表达的作用分别依赖MAPK途径和Src活化

目的探讨IL-6、IL-8促进卵巢癌细胞增殖的分子机制。方法在以往工作的基础上,选择兼有IL-6、IL-8受体及雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的卵巢癌细胞系SKOV-3和OVCAR-3作为研究模型,观察AR阻断剂氟他胺(flutamide,Flu)对IL-6、IL-8诱导的促卵巢癌细胞增殖作用的影响,在此基础上进一步探讨两种细胞因子对AR表达的调节作用及相关信号传导通路。结果①AR阻断剂Flu不能阻断反而增强IL-6、IL-8诱导的促卵巢癌细胞增殖效应。②在无雄激素的条件下,IL-6、IL-8不仅能增加AR表达而且还能活化AR基因启动子,后者可被Flu完全阻断。③IL-6诱导的AR水平增加可被p38 MAPK、MEK1/2及ErbB2 MAPK阻断剂阻断,而IL-8诱导的AR水平增加则可被Src阻断剂阻断。结论IL-6、IL-8很可能通过提高AR水平和AR活性从而增强卵巢癌细胞对雄激素的敏感性,由此通过产生的放大信号通路促进卵巢癌的生长和发展。IL-6、IL-8的上述活性分别依赖MAPK途径和Src活化。

高通量筛选JAK-STAT6信号传导通路抑制剂方法的初步建立

目的构建可用于高通量筛选JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的工程细胞株,建立稳定可靠的筛选方法。方法利用基因重组和转染技术,将STAT6特异性识别启动子IgE基因序列和虫荧光素酶报告基因联合插入pCMV质粒,脂质体法转染至HeLa细胞,经潮红霉素B抗性筛选及报告基因检测,得到稳定表达虫荧光素酶的工程细胞株。通过优化溶剂DMSO浓度,IL4作用浓度及孵育时间等筛选条件,建立了可靠的筛选方法,并在此基础上对1600种化合物进行了筛选。结果建立的筛选方法稳定可靠,系统Z′因子达到0.64。通过对1600种化合物的筛选,得到3个抑制效果较理想的化合物并测得其IC50值。结论所建立的高通量筛选方法可用于JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的筛选。

兔自身免疫性干眼模型的建立及泪腺炎症因子研究

目的通过静脉回输自体激活的淋巴细胞建立稳定的兔自身免疫性干眼模型,并分析干眼的泪腺炎性因子,探究干眼的泪腺免疫反应。方法通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞,建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。结果与正常对照组相比,干眼模型组泪液分泌显著减少(t=115.6,P<0.05),泪膜破裂时间缩短(t=92.5,P<0.05)。荧光素钠染色显示角膜弥漫性点状着色,正常对照组基本无着色。泪腺组织HE染色显示淋巴细胞浸润,正常对照组很少。RT-PCR结果显示,干眼模型组泪腺中炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-17 mRNA相对表达量显著升高(t=26.2、18.7、8.4;均为P<0.05),抑炎因子IL-10、TGF-βmRNA相对表达量显著降低(t=22.1、14.2;均为P<0.05)。结论经兔泪腺上皮细胞激活的自体外周血淋巴细胞静脉回输后,成功诱发干燥综合征样自身免疫泪腺炎,建立了稳定的兔自身免疫性干眼模型。泪腺组织中细胞因子IL-6、IL-17、IFN-γ、TGF-β、IL-10参与泪腺内炎症反应的发生和发展。

Krüppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

背景 研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42、7.31,P＜0.05）.Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义（F=591.858,P＜0.05）,pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义（F=54.825,P＜0.05）. 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.

重组pEGFP-C2-p100质粒构建及表达

目的:将人类p100基因定向连入pEGFP-C2质粒,使p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究p100蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoRI和BamHI双酶切方法,从pSG5-p100质粒中获得p100蛋白的cDNA全长;将该cDNA连接入pEGFP-C2质粒。将构建成功的pEGFP-C2-p100质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见p100片段。(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)p100 cDNA全长成功载入pEGFP-C2质粒。(2)p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。

GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达

目的:构建GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达。方法:PCR扩增G3BP Domain1～5片段,利用限制性内切酶EcoRI和NotI将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glutathione beads钓取目的蛋白。结果:G3BP Domain1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。结论:GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒构建成功。

pEGFP-CI-G3BP转染Hela细胞及其在细胞中的表达

目的:了解G3BP蛋白在细胞中的表达及定位。方法:利用脂质体lipofectamine2000将提取的质粒pEGFP-CI-G3BP转染进入Hela细胞,培养24h后荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达情况及其在细胞中的定位。结果:pEGFP-CI-G3BP质粒被成功转入Hela细胞内,转染后绿色荧光可高效表达,分布在细胞胞浆中。结论:脂质体法是一种高效的转染pEGFP-CI-G3BP的方法,表达的G3BP蛋白定位于细胞的胞浆部分。

重组pEGFP-C2-FOXC1-C真核表达质粒的构建与表达

目的:将人FOXC1-C基因定向连入pEGFP-C2质粒,使FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究FOXC1-C蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoR I和NotI双酶切方法,从pcDNA3.1(+)-FOXC1-C质粒中获得FOXC1-C蛋白的cDNA羧基末端;连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-FOXC1-C质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见FOXC1-C片段;(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)FOXC1-C cDNA羧基末端成功连入pEGFP-C2质粒(;2)FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1／VEGF信号通路的抑制作用

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用。但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚。目的研究PSF对IGF-1／血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的调控作用。方法将猕猴视网膜血管内皮细胞RF／6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil．PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组，分别在细胞中转人真核质粒Pegfp—C2-PSF、pGenesil—PSF—RNAi及相应的空白质粒。各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1（IGF-1）以刺激细胞生长，采用MTT法检测各组RF／6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量，用于进一步的实验。采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF／6A细胞中VEGFmRNA的表达；采用Westernblot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶（ERK）活化的促进作用。结果IGF-1刺激后Pegfp．C2．PSF质粒转染组以0．50IxgPSF为最适剂量，其RF／6A细胞的增生率为0．220±0．020，细胞中VEGFmRNA相对表达量为0．79±0．07，分别低于其对照组的0．260±0．006和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．040、0．016）；IGF-1刺激后pGenesil—PSF—RNAi质粒转染组以1．00IxgPSF作为最适剂量，其RF／6A细胞增生率为0．35±0．02，VEGFmRNA相对表达量为2．29＋0．43，分别高于其对照组的0．210-4-0．019和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．003、0．019）。IGF-1刺激后1、3、6hPegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．000、0．000）。Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126’处理后细胞中VEGFmRNA的相对表达量为0．93±0．21，明显低于未转染组的1．32±0．08，差异均有统计学意义（P=0．037），同时明显低于Pegfp—C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGFmRNA的相对表达量1．23±0．09，差异有统计学意义（P=0．002）。结论PSF可抑制IGF-1诱导的RF／6A细胞中的ERK信号通路的活化，下调VEGF在RF／6A细胞中的表达，进而抑制RF／6A细胞的增生。

Kuippel样因子6经活化转录因子4通路对晶状体上皮细胞凋亡的调控作用

目的以活化转录因子4（ATF4）为靶点，探讨Krüppel样因子6（KLF6）调控紫外线B（UVB）诱导的晶状体上皮细胞（HLECs）凋亡的分子机制。方法HLECs系（HLE-B3）进行常规培养，采用脂质体转染法将构建的真核表达质粒pEGFP-C2-ATF4转染HLECs作为UVB＋ATF4转染组，并用能量密度为20 mJ/cm2的UVB照射细胞；未转染的ATF4细胞作为正常对照组。采用苏木精－伊红染色法和Hoechst染色法观察ATF4对HLECs细胞形态学的影响。将培养的细胞分为KLF6转染组及相应空质粒对照组，小干扰KLF6（siKLF6）组（转染pSilencer-KLF6质粒）及相应的空载体对照组（转染pSilencer空质粒），采用Western blot法检测细胞中ATF4蛋白的相对表达量。将培养的细胞分为4个组，联合空载体组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer空载体；KLF6＋pSilencer空质粒组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer空载体；小干扰ATF4（siATF4）＋pEGFP-C2组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer-ATF4；KLF6＋siATF4组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer-ATF4，各组细胞均暴露于UVB 200 s，采用ELISA法检测上述各组HLECs凋亡值。结果正常对照组培养的HLECs大小均匀，排列整齐，细胞核呈卵圆形，数量多且完整；UVB照射后部分细胞核固缩，细胞间隙增大，少数细胞出现核分裂；UCB＋ATF4转染组细胞数量减少，多数细胞出现核固缩和核分裂。UVB＋ATF4转染组细胞中ATF4蛋白表达条带灰度明显强于UVB＋空载体组，ATF4蛋白相对表达量分别为0.99±0.06和0.13±0.02，差异有统计学意义（t＝23.13，P〈0.01）。KLF6转染组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显高于其空载体对照组，siKLF6组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显低于其空载体对照组，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。ELISA检测显示ATF4转染组HLECs凋亡值为1.37±0.11，明显高于正常对照组的0.31±0.11，差异有统计学意义（t＝8.034，P＝0.001）；KLF6＋pSilencer空质粒组细胞凋亡值明显高于联合空载体组，siATF4＋pEGFP-C2组细胞凋亡值明显低于联合空载体组，差异均有统计学意义（P〈0.01，P＝0.02）；KLF6＋siATF4组细胞凋亡率明显低于KLF6＋pSilencer空质粒组，差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论KLF6通过活化ATF4促进UVB诱导的HLECs凋亡，ATF4基因沉默可使细胞凋亡值明显降低，因此ATF4可作为KLF6调控HLECs凋亡的靶因子，也是KLF6调控LECs凋亡的主要生物机制之一。

叉头框转录因子F2小发夹RNA对人眼小梁网细胞外基质蛋白表达的抑制作用

目的探讨叉头框转录因子F2(FoxF2)对小梁网细胞外基质表达的调控作用。方法将培养人眼小梁网细胞(HTMCs)分为Scramble对照组和FoxF2小发夹RNA(shRNA)组,构建FoxF2重组干扰载体FoxF2 shRNA,应用FoxF2 shRNA慢病毒颗粒感染HTMCs,采用Western blot法检测FoxF2 shRNA的敲低效果及细胞外基质(ECM)蛋白的表达变化,利用Transwell计数实验分析HTMCs的迁移能力。结果体外培养的HTMCs呈长梭形,生长状态良好,形态符合HTMCs形态学特征。FoxF2 shRNA组FoxF2蛋白相对表达量为0.72±0.02,显著低于Scramble对照组的1.27±0.05,差异有统计学意义(t=16.68,P<0.01)。FoxF2shRNA组纤连蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对表达量分别为0.43±0.03、0.53±0.08和0.86±0.15,显著低于Scramble对照组的0.87±0.04、1.66±0.06和1.73±0.13,差异均有统计学意义(t=15.08、18.81、7.50,均P<0.01)。FoxF2 shRNA组HTMCs的迁移数量为117.30±11.41,显著低于Scramble对照组的251.00±10.37,差异有统计学意义(t=8.72,P<0.01)。结论成功制备可特异性敲低HTMCs内源性FoxF2表达的FoxF2 shRNA病毒,并证实FoxF2干扰对HTMCs中ECM的表达及细胞迁移具有抑制作用。

非甾体类药物预防飞秒激光辅助白内障术中瞳孔缩小的观察与分析

目的探讨飞秒激光术后眼内前列腺素E2(prostaglandin E2)浓度的变化与瞳孔缩小的关系,同时比较术前应用两种非甾体类药物(nonsteroidal drugs,NSAIDs)预防飞秒激光辅助白内障术中瞳孔缩小的效果。方法前瞻性队列研究。研究对象为2014年6月至2015年3月于天津医科大学眼科医院白内障科行白内障手术的老年性白内障患者120例(120眼),根据手术方式及用药分为4组,其中拟行传统超声乳化手术30例(30眼)为A组;拟行飞秒激光辅助白内障手术90例(90眼)随机分为3组,其中空白对照组为B组,术前应用1 g·L^(-1)普拉洛芬滴眼液为C组,术前应用1 g·L^(-1)双氯芬酸钠滴眼液为D组。收集包括患者年龄、性别、晶状体核分级、术前充分散瞳后以及完成飞秒激光或手工透明角膜切口后瞳孔直径等临床资料,测量所有样本中PGE2浓度。结果 A、B、C、D四组中PGE2浓度分别为(48.25±10.52)pg·m L^(-1)、(124.14±8.97)pg·m L^(-1)、(18.28±3.49)pg·m L^(-1)、(19.05±3.13)pg·m L^(-1);B组与A、C、D组差异均有统计学意义(均为P<0.000 1),C组与D组差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C、D四组术中瞳孔缩小的发生率分别为6.67%(2/30)、20.00%(6/30)、3.33%(1/30)、3.33%(1/30);B组与A、C、D组差异均有统计学意义(均为P<0.05),C组与D组差异无统计学意义(χ2=0.001,P>0.05)。瞳孔缩小与年龄、性别及晶状体核分级均无相关性(均为P>0.05)。发生瞳孔缩小者与未发生瞳孔缩小者PGE2浓度分别为(130.74±8.76)pg·m L^(-1)、(120.86±7.27)pg·m L^(-1),差异有统计学意义(P<0.05),瞳孔缩小程度与PGE2浓度无相关性(P>0.05)。结论飞秒激光术后瞳孔缩小可能与房水中PGE2浓度升高有关,术前局部应用NSAIDs能降低眼内PGE2浓度,减少飞秒激光术后瞳孔缩小的发生。

高表达Krüppel样因子6对紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)高表达对于紫外线B(UVB)诱导晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的影响。方法利用脂质体转染的方法将已成功构建的真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6转染到HLECs中,采用Westernblot法测定细胞中KLF6蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染后细胞活力;经苏木精-伊红染色法观察细胞形态;采用Live/Dead染色法观察细胞受损情况;采用Westernblot法检测细胞中凋亡标志物bax和bcl-2的相对表达量,并计算bax/bcl-2比值;采用细胞凋亡检测试剂盒定量测定细胞凋亡水平,并检测细胞中活性氧簇(ROS)的表达水平。结果0.5μg转染组和1.0μg转染组细胞生存力较空载体对照组下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。KLF6高表达组细胞稀疏,细胞形态狭长,细胞质浓缩。正常对照组细胞形态稳定,数量均匀,为绿色活细胞;KLF6高表达组红色死亡细胞数量显著增多。UVB照射后,KLF6高表达组HLECs细胞凋亡值、bax相对表达量、bax/bcl-2比值、ROS表达量均高于空载体对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论高表达的KLF6通过调控凋亡相关蛋白的表达及促进内质网内ROS堆积来加剧UVB照射导致的HLECs凋亡,提示KLF6参与HLECs的凋亡调控。通过生物学手段特异性下调KLF6的表达有可能在一定程度上发挥对HLECs的保护作用。

间充质干细胞对EAU大鼠抗原特异性T细胞和抗原递呈细胞功能的抑制作用

背景 我们前期研究发现,间充质干细胞（MSCs）可以有效治疗大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）,减轻组织损害,但其具体作用机制仍在研究中.目的 研究MSCs对大鼠EAU模型中T细胞亚群和抗原递呈细胞（APCs）的影响.方法 收集6只清洁级4～6周龄Wistar雄性大鼠双侧股骨、胫骨骨髓,采用贴壁培养法纯化Wistar大鼠骨髓MSCs.采用随机数字表法将12只清洁级Lewis雌性大鼠分为MSCs组和PBS组,每组6只.于Lewis大鼠单后足及背部皮下注射200μl含30μg光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP） 1177-1191多肽片段R16及完全弗氏佐剂（CFA）的乳化液以建立EAU模型,造模后于裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部炎症表现.造模后9～11d,MSCs组大鼠每日经尾静脉注射密度为5×106/ml的MSCs悬液1 ml;PBS组大鼠以同样的方法注射等容积的PBS.造模后15d,分离各组大鼠脾脏和引流淋巴结中的T细胞及APCs,采用流式细胞仪检测各组大鼠脾脏和引流淋巴结中γ干扰素（IFN-γ）阳性CD4＋T细胞、白细胞介素-17（IL-17）阳性CD4＋T细胞和叉头状螺旋转录因子p3（Foxp3）阳性CD4＋T细胞的比例,以评估辅助性T细胞1（Th1）、Th17和调节性T细胞（Treg）细胞亚群的作用;依据各组T细胞与APCs共培养的方式不同分为PBS共培养组、PBS-MSCs交叉培养组、MSCs-PBS培养组和MSCs共培养组,分别加入不同质量浓度（0.3、1.0、10.0 μg/ml）的R16抗原进行刺激,无R16抗原刺激的细胞作为空白对照,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）法测定各组大鼠T细胞吸光度（A）值,计算T细胞增生指数.结果 造模后11、12、13和14d,MSCs组大鼠眼前节炎症评分均明显低于PBS组,差异均有统计学意义（t=3.825、5.100、4.250、3.400,均P＜0.05）.与PBS组大鼠比较,MSCs组大鼠脾脏和淋巴结中IFN-γ＋ CD4＋T细胞比例均明显下降,差异均有统计学意义（t=5.651、4.376,均P＜0.05）;MSCs组大鼠脾脏和引流淋巴结中IL-17＋CD4＋T细胞比例均明显下降,差异均有统计学意义（t=3.300、4.925,均P＜0.05）,Foxp3＋ CD4＋T细胞的比例均明显升高,差异均有统计学意义（t=-5.172、-2.825,均P＜0.05）.PBS共培养组大鼠脾脏T细胞增生指数随着R16抗原质量浓度的增加而升高,在各自质量浓度（0.3、1.0和10.0 μg/ml）R16刺激条件下,MSCs共培养组T细胞增生指数较PBS共培养组明显下降,差异均有统计学意义（P=0.027、0.000、0.000）;在R16质量浓度为1.0 μg/ml和10.0 μg/ml条件下,MSCs-PBS交叉培养组和PBS-MSCs交叉培养组T细胞增生指数均明显低于PBS共培养组,差异均有统计学意义（1.0μg/ml R16：P=0.001、0.000;10.0μg/ml R16：P=0.000、0.000）.结论 MSCs可通过同时抑制EAU大鼠体内抗原特异性T细胞和APCs的功能以及上调Treg细胞比例来发挥对大鼠EAU的治疗作用.

原发性开角型青光眼房水差异表达蛋白分析

目的分析原发性开角型青光眼(POAG)患者房水的蛋白质表达变化,探寻与疾病发生相关的生物学标志及潜在治疗靶点.方法采用回顾性病例-对照研究设计.纳入2016年10月至2017年12月由天津医科大学眼科医院收治的行白内障手术的年龄相关性白内障患者10例10眼作为年龄相关性白内障组,行青光眼联合白内障手术的POAG合并白内障患者10例10眼作为POAG合并白内障组.术中借助手术通道用1号针头接1ml针筒进入前房中部吸取约100μl房水.通过非标记定量蛋白质组学质谱分析技术分析房水中提取的蛋白,采用Maxquant significancesA的方法进行差异显著性检验,以P<0.05、差异倍数>2的标准筛选得到2个组患者的差异蛋白,并将生物大数据通过GO功能、KEGG显著性富集分析对差异蛋白的功能及调控的信号通路加以注解.结果本次蛋白组学分析共检测到97个差异蛋白,其中包括48个上调蛋白和49个下调蛋白.GO分析显著差异蛋白功能涉及诸多方面,其中与炎症反应有关的有脂多糖结合蛋白(LBP)、CD163、C-反应蛋白(CRP)和膜联蛋白A1(ANXA1);与氧化还原有关的蛋白有谷胱甘肽S转移酶P(GSTP1)和硫氧还原蛋白(TXN);与细胞黏附运动有关:软骨寡聚基质蛋白(COMP)、桥粒胶蛋白(DSC2)和层连蛋白(LAMB2);与纤维化有关的有原胶原蛋白(PLOD1)和固生蛋白(TNC);与神经生长有关:颤蛋白(RELN)、脑信号蛋白(SEMA3F)和轴突导向因子(SEMA4B);与代谢相关的蛋白有丙酮酸激酶(PKM)和羧肽酶N亚型2(CPN2)等.KEGG分析表明NrF2/ERK信号通路、TGF-β/NF-κB信号通路表达在2个组细胞间存在差异.结论POAG患者房水中GSTP1、TXN表达显著降低,可能通过调控NrF2/ERK1/2及TGF-β/NF-κB信号通路,调节细胞黏附性和活性以及细胞外基质表达来参与疾病的发展.GSTP1、TXN可能成为潜在生物学标志及治疗靶点.

睫状神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的构建

背景 间充质干细胞作为基因转移的载体,已在多种疾病的研究中发挥作用.该方法可能为外源性神经营养因子在中枢神经系统,包括在视网膜中的应用提供更有效的途径. 目的 构建慢病毒介导的过表达睫状神经营养因子（CNTF）的骨髓间充质于细胞（BMSCs）,为眼科视网膜、视神经疾病的治疗提供新的方法.方法 对SD大鼠BMSCs进行培养和传代,第4代细胞用于实验.将全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列克隆至pHⅣ-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato.CNTF-dTomato/pHⅣ-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及不含CNTF的control-lenti.以CNTF-lenti或control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率;未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.用ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度.将CNTF-BMSCs向成骨和成脂2个方向诱导分化,并用茜素红S（ARS）染色和油红O染色对分化细胞进行鉴定.结果 CNTF-dTomato质粒转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞后,菌落PCR产物大小约为1 033 bp,质粒测序结果显示,pHⅣ-dTomato质粒中插入部分的碱基序列与预期序列一致,显示CNTF-dTomato质粒构建成功.重组慢病毒对BMSCs的感染率达95％.ELISA检测结果显示,感染后2、3、4、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义（均P=0.000）;CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义（P=0.013、0.004、0.042）.CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红0染色呈红色着染,经成骨培养基诱导后分化的细胞ARS染色可见橘红色钙结节. 结论 本研究成功构建CNTF-dTomato质粒,利用慢病毒载体可成功构建稳定过表达分泌型CNTF的大鼠BMSCs,CNTF-BMSCs具备向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能.

大鼠非动脉炎性前部缺血性视神经病变模型视神经蛋白质组学分析

目的定量分析SD大鼠非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)模型中视神经组织蛋白表达变化,并对差异蛋白进行生物信息学分析。方法选取10只8周龄体质量200~250 g的SPF级雄性SD大鼠,采用孟加拉玫瑰红联合激光光动力方法建立NAION模型,最终选取4只造模成功的大鼠作为NAION模型组,同时取4只体质量和周龄相匹配的健康、无眼疾SD大鼠作为正常对照组。于造模后7 d,分离各组大鼠球后视神经,采用酶切法进行样本制备,采用同位素标记相对和绝对定量标记结合液相色谱-串联质谱技术对组织蛋白进行质谱鉴定和定量检测,选取组间表达倍数大于1.5倍且差异有统计学意义(P<0.05)的蛋白为差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果造模后3 d,NAION模型组大鼠视盘隆起,荧光素眼底血管造影图像显示视盘区有荧光素钠渗漏,模型建立成功。共鉴定出1291个可定量蛋白,其中差异蛋白80个。与正常对照组比较,NAION模型组中表达上调的蛋白5个,表达下调的蛋白75个。V型胶原α1链(Col5A1)和cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基β(Prkacb)、G蛋白相关支架蛋白(Dlg1)等蛋白表达升高;神经微丝蛋白(Nefm)、微管相关蛋白1b(Map1b)、Ras相关蛋白(Rala)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2(Pkn2)、血小板活化因子乙酰水解酶IB亚基(Pafah1b1)等蛋白表达降低。差异蛋白主要参与细胞骨架的调节、细胞对缺氧的反应、轴突生成及延伸、突触调节、神经元凋亡调控、轴浆运输等生物学进程。京都基因与基因组通路富集分析结果显示,差异蛋白主要参与代谢通路、突触囊泡循环、血小板活化等信号通路。结论神经生长、能量代谢、轴浆运输及凋亡等信号通路相关蛋白的表达共同参与NAION中神经细胞的凋亡。