HLA新等位基因B*46:30序列分析及其编码MHC蛋白分子结构预测与表型鉴定

目的:鉴定分析HLA新等位基因B*46:30序列,对其MHC蛋白分子三级结构及氨基酸残基改变对蛋白结构的可能影响进行模拟分析,并对其血清学表型进行鉴定。方法:应用Luminex SSOP流式、PCR-SBT及单等位基因特异性测序对HLA序列进行序列鉴定。应用SWISS-MODEL及RCSB PDB分析软件,对HLA序列蛋白分子三维结构进行模拟分析。HistoCheck、FATCAT对比分析蛋白分子间差异。使用Terasaki分型板进行血清型表型鉴定。结果:相较于B*46:01,新等位基因B*46:30第559、560位发生C->G、T->A替代。MHC分子结构预测分析表明,B*46:30第163位氨基酸残基由疏水性脂肪族亮氨酸Leu→B*46:30带负电荷的酸性谷氨酸Glu,R值为32。该氨基酸变异位置位于α2结构域构成抗原多肽结合凹槽侧壁的α螺旋顶端,总差异值DSS Score=1.32,均方根偏差RMSD=0.59?,血清型表型检测为B46强阳性。结论:HLA新等位基因序列被WHO HLA命名委员会正式命名为B*46:30,分析预测此编码氨基酸残基改变将可能影响其抗原多肽结合功能,并影响其与TCR及抗体的结合特性,血清型表型鉴定为B46。

核酸检测技术与酶联免疫检测技术在血液筛检中的初步应用比较

目的了解山东地区献血者的乙肝病毒感染状况并为今后开展常规核酸检测技术(NAT)检测提供实验依据。方法使用ELISA和NAT检测法筛选无偿献血者血液样本11334份,应用实时荧光定量PCR仪检测样本的HBV DNA含量。结果在11334份血液样本中发现HBsAg EIA和NAT同时阳性的样本237份,HBsAg EIA阴性但NAT阳性的样本7份和HBsAg EIA阳性但NAT阴性的样本23份。结论核酸检测能够提高HBV的检测灵敏度,荧光定量PCR仪可以应用于献血者的大规模筛选。

山东汉族人群血小板抗原基因多态性分析

目的:探讨山东汉族人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA)1-17、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A、B多态性分布。方法:对山东地区962位无血缘关系的汉族血小板自愿捐献者采用PCR-SSP方法进行HPA1-17系统的基因分型,采用PCR-SSOP技术对HLA-A、B位点进行基因分型,直接计数法计算基因频率,HPA1-17及HLA基因型组合用Arelequin 3.5进行分析。结果:HPA各等位基因频率分别是1a:0.9918,1b:0.0082,2a:0.9419,2b:0.0592,3a:0.5841,3b:0.4174,4a:0.9969,4b:0.0031,5a:0.9892,5b:0.0108,6a:0.9835,6b:0.0175,7-14a:1,7-14b:0,15a:0.5488,15b:0.4512,16a:1,16b:0,17a,17b:0;频率最高的HPA基因组合型为:HPA-(1,2,4,5,6,7-14,16,17)aa-3ab15ab(0.2048);HLA-A、B位点中频率最高的基因分别为A*2(0.3094)、B*13(0.1513),频率最高的HLA基因组合型为:HLA-A*02~B*13(0.1397)。结论:山东汉族人群HPA和HLA分布具有明显多态性,与其他人群相比显示出地域和种族性差异,应建立本地区的血小板捐献者HPA和HLA分型资料库。

224例血友病A患者输血感染病毒状况研究

对224例血友病A患者输注凝血因子制品治疗和预防出血,应用ELISA法检测其HBsAg、抗-HCV、抗-HIV,并对不同年龄和不同输血次数的患者分别进行比较。结果224例血友病A患者的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV阳性率分别为7.8%、27.3%和0。年龄<10岁和≥10岁的患者HBsAg、抗-HCV阳性率分别为5.2%、14.6%和8.2%、36.5%,两者有显著统计学差异(P<0.05);输血<5次和≥5次患者的HBsAg、抗-HCV阳性率分别为6.6%、15.7%和8.4%、34.6%,两者有统计学差异(P<0.05)。表明血友病A患者的抗-HCV阳性率显著高于正常人群,并与年龄和输血次数密切相关。

中国汉族人Rh血型系统D阴性表型的分子机理研究

金鸡辞旧,瑞犬迎新,值此佳年盛世,山东省血液中心与《山东医药》携手合作,共同推出“输血研究“栏目。本栏目旨在贯彻党和国家的卫生工作方针政策,坚持临床与基础结合,理论与实践结合,普及与提高结合,充分展示血液领域取得的新成果、新技术、新理论、新经验,反映国内外最新的输血研究动态,为各级各类医疗卫生机构和输血工作者,提供一个促进学术交流和信息传播的平台。我们热切希望和广大作者、读者一道精诚合作、并肩耕耘,为全面提高我省输血医学科研水平,促进输血事业发展做出贡献。

维生素B_2光化学技术对单采血小板中白细胞和血小板源细胞因子释放的影响

目的:探讨维生素B_2光化学病原体灭活技术(PRT)处理的单采血小板对白细胞和血小板源细胞因子释放的影响。方法:随机选取捐献血小板的献血员20人,各取60 ml去白细胞单采血小板,平均分成2份:一份不做处理作为对照组,另一份采用维生素B_2联合紫外光照射的光化学法处理作为实验组。在血站标准条件下保存7d,分别于1、3、5和7 d取样,分析血小板计数(PC)、血小板分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV);应用ELISA方法检测白细胞源细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ)和血小板源细胞因子(CCL3、CCL5、TGF-β-1和PF4)含量以及可溶性P-selectin含量;流式细胞术检测血小板膜磷脂酰丝氨酸(PS)表达水平。结果:实验组与对照组相比,PC、PDW和MPV没有统计学差异。随着血小板贮存期的延长,血小板源性细胞因子含量逐渐增加,5-7 d时达到一个新的高度平台,且实验组中血小板源性细胞因子的含量显著高于对照组(P<0.05)。在血小板贮存的3、5和7 d时,实验组中PS表达阳性率显著高于对照组(P=0.0052,P=0.010,P=0.011)。在5和7 d时,实验组中P-selectin含量显著高于对照组(P=0.0138,P=0.0036)。白细胞源性细胞因子含量在实验组和对照组中相比较差异无统计学意义。结论:经PRT处理的去白细胞血小板中,细胞因子的释放主要来源于血小板,在贮存5和7 d时,血小板源性细胞因子的积累达到一个新的平台,其原因最可能是血小板的活化和凋亡。

M-sol血小板保存液中添加花生四烯乙醇胺对体外保存血小板的影响

本研究探讨在M-sol(mixture of solutions)血小板保存液中添加花生四烯乙醇胺(N-arachidonoylethanolamine,ANA)对体外保存血小板的影响。利用Amicus血细胞分离机采集无偿献血志愿者的血小板,血小板保养液为M-sol,实验组加入终浓度为0.1-50μmol/L的ANA,未加入ANA的另一组作为对照,置于22±2℃振荡仪中保存。于第7 d取样,用MTT比色法分析血小板的存活率。选定最佳浓度的ANA加入血小板保存液中,分别于第1、5、7、9和11 d取样,检测血小板计数(BPC)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板磷脂酰丝氨酸(PS)膜外表达以及可溶性P-选择素(sP-selectin)含量。结果发现,加入终浓度为0.5μmol/L ANA的血小板存活率(91.23±5.44%)最高,与对照组(62.54±4.79%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05);保存第1、5、7、9和11 d实验组与对照组BPC均有下降趋势,但两组相比差较异均无统计学意义(P均>0.05);保存期间血小板MPV和PDW有增加趋势,实验组与对照组相比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。保存到第9和11 d血小板膜外PS的表达,在实验组PS表达阳性率显著低于对照组(7.69±1.82%vs 11.21±2.03%;10.74±1.78%vs15.37±1.95%),两组相比较差异具有统计学意义(P均<0.05);保存期间可溶性P-选择素含量在两组中均有增加趋势,实验组可溶性P-选择素含量显著低于对照组(30.19±2.03 ng/mL vs 39.18±2.66 ng/mL;34.52±2.64ng/mL vs 43.23±2.58 ng/mL),两组相比差较异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:将低浓度ANA加入血小板M-sol保存液中,在一定程度上可以减轻血小板贮存损伤。

山东省区域性血小板供者信息网络建设及应用

由于血小板带有ABO、HLA和HPA等复杂的抗原系统，多次输血的患者因同种免疫产生相应的血小板免疫性疾病，其中血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR）更是成为临床血小板输血中的突出问题。患者往往因达不到预期的输注效果而延误病情，同时也增加了经济负担。此外，随着医疗事业的改革和发展，血小板的临床需求逐年增加，甚至发生供应紧张的情况。如何提高血小板输注效果，充分利用有限的血小板资源，已成为输血医学界研究的课题之一。

HLA新等位基因A~*02:355序列及其编码蛋白分子三维结构模拟分析

目的:鉴定分析HLA新等位基因A*02:355的序列变异并预测分析其氨基酸残基改变在编码蛋白分子三维空间结构中的影响。方法:应用Luminex SSO流式、PCR-SBT及单等位基因特异性测序对1例A位点变异序列进行鉴定。应用Phyre2蛋白折叠识别在线服务器以及RasMol和PDB Protein Workshop分析软件,对其编码蛋白分子三级结构及其氨基酸残基改变特点在MHC分子三维空间结构中所处位置及可能影响进行模拟分析。结果:相较于A*02:03:01,其第98、102位核苷酸发生T->A、A->C替代,导致其编码氨基酸发生9F→Y改变。其编码蛋白分子三维结构模拟分析表明,该氨基酸变异位置位于α1和α2结构域抗原多肽结合凹槽β折叠片层底面的第1 β股链的中心位置,该位置亦参与构成抗原多肽结合凹袋B和凹袋C。结论:该等位基因序列被WHO HLA命名委员会正式命名为A*02:355。分析预测此编码氨基酸改变将可能影响其MHC分子的抗原多肽结合及呈递功能。

利用唾液标本进行HLA分型的可行性分析

目的探讨利用唾液样本提取DNA进行HLA高分辨分型的可行性。方法采集6例造血干细胞移植患者和10例供者唾液样本各2 m L,EDTA抗凝静脉全血3 m L。采用Qiagen全血基因组提取试剂盒和Oragene唾液DNA提取试剂盒分别于全血和唾液样本中提取DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。采用PCR-SSOP和PCRSBT方法对血液提取DNA和唾液提取DNA进行HLA高分辨分型,并对分型结果进行比较。结果唾液提取DNA浓度69.75±44.96,A260/A280比值为1.77±0.07;血液提取DNA浓度63.06±33.99,A260/A280比值为1.75±0.04。唾液来源DNA PCR-SSOP结果明确,DNA PCR-SBT高分辨分型中无杂峰和碱基错配。16例样本唾液来源DNA的HLA高分辨分型结果和血液来源DNA的结果完全一致,符合率为100%。结论唾液提取的DNA可用于HLA高分辨分型。

山东地区汉族人群HLA-C基因分组与梅毒的相关性研究

目的探讨HLA-C基因分组与梅毒的相关性,以期发现梅毒的抗性基因型。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,对山东汉族231例梅毒患者和247例健康个体的HLA-C基因分组进行检测和分析。结果梅毒患者组HLA-C1C1基因型频率显著低于对照组(P<0.05),HLA-C1C2和HLA-C2C2以及HLA-C1组和HLA-C2组的基因型频率在2人群中相比差异无统计学意义。结论在山东汉族人群中HLA-C1C1可能是梅毒的抗性基因型。

花生四烯乙醇胺对血小板线粒体细胞色素C的释放和细胞凋亡的影响

目的探讨花生四烯乙醇胺(ANA)对血小板线粒体细胞色素C(Cyt-C)的释放和细胞凋亡的影响。方法将从无偿献血者中采集的血小板,分为实验组(n=20):加入终浓度为0.5μmol/L的ANA;对照组(n=20):未加ANA;2组均置于(22±2)℃水平振荡的振荡仪保存7 d。Western blot检测血小板线粒体Cyt-C的释放和caspase-3的表达、流式细胞仪检测血小板磷脂酰丝氨酸(PS)膜外表达,ELISA方法检测caspase-3的活性。结果实验组与对照组比较,PS表达阳性率:(8.29±1.44)%vs(14.24±2.47)%(P<0.05);caspase-3活性形式表达量:(0.063±0.014)%vs(0.132±0.025)%(P<0.05);caspase-3活性:0.096±0.04 vs 0.208±0.03(P<0.05);Cyt-C从线粒体释放到胞浆的数量比值:(3.18±1.32)%vs(15.13±3.40)%(P<0.05)。结论 ANA降低血板PS的膜外表达、减少线粒体Cyt-C的释放以及降低caspase-3活性,延缓了血小板凋亡。提示ANA可能通过抑制线粒体介导的途径抑制血小板凋亡。

HLA新等位基因DRB1＊03：80的鉴定及其序列分析

本研究旨在分析鉴定中国人群HLA-DR位点1个新等位基因。应用Luminex PCR-SSO流式分型技术发现1例罕见等位基因组合样本,应用PCR-测序分型(sequence-based typing,SBT)及单等位基因特异性测序分型技术进行鉴定分析。结果表明,该样本DR位点1个等位基因序列与同源性最高的DRB1*03:06等位基因相比,其第2外显子第239位核苷酸碱基由C→G,结果导致相应51位密码子编码的苏氨酸变为精氨酸。结论:确定了该样本含有1个HLA-DRB1新等位基因。该等位基因被WHO HLA因子命名委员会正式命名为DRB1*03:80。

高效液相色谱法与凝胶层析法检测人血白蛋白制剂中多聚体的比较

对12批人血白蛋白制剂分别以HPLC法重复测定5次及用凝胶层析法重复测定4次.结果表明:HPLC法（RSD 0.23％～2.86％）较凝胶层析法（RSDI.1.41％～5.70％）结果准确;HPLC法作品不稀释,直接进样,每样仅需30 min,操作简便易行,可作为白蛋白制剂中多聚体的含量测定方法。

山东地区汉族骨髓捐献者HLA-DRB1基因分型及多态性分析

目的观察山东地区汉族人群人白细胞抗原(HLA)-DRB1基因多态性及其分布特点。方法采用聚合酶链反应—测序为基础的分型方法(PCR-SBT)对随机抽取的909例中华骨髓库山东分库内山东汉族骨髓供者血样进行HLA-DRB1基因分型和多态性分析。结果共检测出42种HLA-DRB1等位基因,其中HLA-DRB1*0901等位基因频率最高(16.28%),其次为HLA-DRB1*1501(15.13%)和HLA-DRB1*0701(14.04%),基因频率最低的是DRB1*0408、DRB1*0809、DRB1*1103、DRB1*1303、DRB1*1412、DRB1*1425、DRB1*1601,各占0.06%。山东汉族骨髓供者HLA-DRB1等位基因的分布与江苏、湖北、新疆、广东、韩国、日本和德国人群存在明显差异(P均<0.05)。结论掌握了山东地区汉族人群HLA-DRB1基因多态性及其分布特征。

核苷类似物的干扰素诱导作用研究

对新合成的１２种核苷类似物进行了小鼠血清干扰素（ＩＦＮ）诱导作用研究。结果表明：目标化合物诱导小鼠血清ＩＦＮ作用以Ａ２、Ａ９较高，Ａ３、Ａ６及Ａ５次之，Ａ３与Ａ６的抗病毒活性与ＩＦＮ诱导活性不平方，提示Ａ３、Ａ６可能对病毒有双重抑制作用，即直接抑制病毒复制及通过诱导ＩＦＮ抑制病毒复制。

SPE-HPLC法检测病毒灭活血浆中的残留亚甲蓝

目的建立SPE-HPLC法检测病毒灭活血浆中亚甲蓝浓度的方法并对病毒灭活血浆中的残留亚甲蓝进行质控检测。方法血浆样品经Waters Oasis HLB固相萃取柱提取,采用迪马DiamonsialC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以甲醇-0.1%乙酸(45∶55,V/V)为流动相,流速为1.0mL·min-1,柱温30℃,检测波长651nm。结果亚甲蓝在0.05～5μmol.L-1范围内线性良好(r=0.9998),最低检出浓度为0.05μmol·L-1。日内、日间RSD均小于8%。结论SPE-HPLC法具有灵敏度高、特异性强的特点,用此法检测的病毒灭活血浆样品中的残留亚甲蓝均达到要求。

取代嘧啶酮类抗病毒药物的研究──Ⅲ．嘧啶酮衍生物诱导血清及组织干扰素活性实验

设计合成了１５个取代嘧啶酮衍生物，进行了诱导小鼠血清和组织器官干扰素的活性实验。结果表明，ＡＢＰＰ和ＡＢＭＰ是活性很强的干扰素诱导剂，而相对应的取代嘧啶硫酮化合物ＡＢＰＰＴ和ＡＢＭＰＴ则诱导活性降低；２位氨基是活性必需基因，２位肼基则无效；化合物６－对磺酸笨嘧啶酮类化合物水溶性强，诱导干扰素能力低；其它化合物血清和组织中诱导干扰素能力均不及ＡＢＰＰ和ＡＢＭＰ。

临床罕见的类孟买血型检测鉴定( 附1例报告)

目的探讨临床罕见的类孟买血型检测鉴定方法,以指导临床输血。方法针对初检ABO血型正反定型结果不符的献血者样本,采用免疫血清学方法鉴定其ABO血型、H抗原、Lea抗原、Leb抗原、弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原、不规则抗体。提取献血者血液基因组DNA,鉴定其ABO血型基因型并对FUT1基因进行测序。结果献血者ABO血型正定型反应表现为O型,反定型反应表现为A型,正反定型结果不符;献血者红细胞上未检测到H抗原,Lea抗原阴性、Leb抗原阳性,Lewis血型系统定型为Le(a-b+);献血者红细胞仅吸收放散出抗-A抗体;不规则抗体为抗H抗体。献血者ABO血型基因型为AA型。FUT1基因第四外显子第658位点发生了C碱基突变为T碱基的改变,即c.658 C>T,且该突变为纯合突变。结论发现1例临床罕见的A型类孟买血型;对临床鉴定困难且怀疑为罕见类孟买血型的血液样本,在免疫血清学方法鉴定不能明确的情况下,可进行基因检测明确其血型,指导临床输血。

LDL-ACM复合物的药代动力学与组织分布

以１２５Ｉ标记的ＬＤＬＡＣＭ 复合物为示踪剂，研究了其在小鼠体内的药代动力学及组织分布。结果表明：小鼠单次尾静脉给药后的药代动力学符合二房室模型一级动力学，其药代动力学参数与天然ＬＤＬ相似；组织分布结果显示，尾静脉单次注入９０ｍｉｎ 后，ＬＤＬＡＣＭ 复合物在Ｈ２２ 荷瘤小鼠体内的分布顺序为肾上腺＞ 肝脏＞ 瘤组织＞ 脾和肾＞ 心和肺。与天然ＬＤＬ的分布基本一致。