葡萄金黄化植原体16SrDNA检测与RFLP分析

【目的】对多种植原体16SrDNA基因序列进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析比较,以期区分葡萄金黄化植原体不同亚种,从而为葡萄金黄化植原体的鉴定提供新依据。【方法】用植原体通用引物R16mF2/R16mR1扩增7种不同植原体16SrDNA基因序列,得到约1.5 kb的DNA片段,将此片段克隆到PGM-T载体,并通过酶切鉴定,对重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性分析,利用限制性内切酶XmnⅠ、XspⅠ、TaqⅠ和RsaⅠ对目的片段进行酶切电泳分析。【结果】所扩增2个不同亚种的葡萄金黄化植原体D型和C型序列同源性最高,达99.72%,但利用限制性内切酶可以将上述2个亚种从植原体榆树黄化组中区分。【结论】利用限制性内切酶分析通用引物R16mF2/R16mR1所扩增的基因片段,可以将葡萄金黄化植原体区分。

土壤中梨火疫病菌实时荧光定量PCR检测及动态分析

【目的】利用实时荧光定量PCR检测土壤中梨火疫病菌(Erwinia amylovora)浓度,明确梨火疫病菌在土壤中的动态变化规律。【方法】2021年3—11月采集库尔勒市发病香梨园810份土壤样品,应用所建立的实时荧光定量PCR检测体系,测定土壤中的梨火疫病菌浓度,同时对梨园发病率及病情指数进行调查。【结果】土壤中梨火疫病菌浓度值变化趋势与梨园病情指数变化趋势一致,4—5月梨园病情指数快速升高至最高值,随着果树生长期延长,病情指数逐渐降低。土壤中梨火疫病菌浓度值从4月逐渐升高,6月平均浓度值为914 CFU·g^(-1),7月平均浓度值最高为965 CFU·g^(-1),随后逐渐降低;6月土壤带菌率为42.2%,浓度值≥10^(3)CFU·g^(-1)的土样13份;7月土壤带菌率为44.4%,浓度值≥10^(3)CFU·g^(-1)的土样26份;6月、7月土壤中梨火疫病菌浓度显著高于4月、10月、11月,致病风险较高。【结论】6月和7月土壤中梨火疫病菌浓度值最高,主要与4月、5月大量病花病果掉落造成病原菌积累有关。加强花期病害防治和梨园病残体清理可有效降低土壤中梨火疫病菌浓度,是降低梨火疫病菌在梨树根部侵染风险的关键点。

向日葵黑茎病菌分离鉴定及其RFLP分析

【目的】对新疆近期发生的向日葵黑茎病进行病原菌分离鉴定,并对该菌进行RFLP分析。【方法】用常规分离培养法从田间采集的向日葵黑茎病病株获得致病菌,观察该菌的形态学特征;用PCR法对该菌ITS区进行扩增和测序,并与向日葵茎点霉黑茎病菌进行分子比对,明确二者的同源性;选取10种限制性内切酶对该菌的ITS区PCR产物进行RFLP分析。【结果】该菌的形态学特征为茎点霉属真菌,与向日葵茎点霉黑茎病菌的同源性达到99%以上,说明该致病菌为向日葵茎点霉黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi。通过RFLP分析确定了该病菌的酶切位点。【结论】该致病菌的形态学和分子生物学鉴定结果表明,向日葵黑茎病由向日葵茎点霉黑茎病菌引起。

向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

【目的】建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi (Persoon) Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法。【方法】用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品。【结果】序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97%。针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370 bp。【结论】成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法。

城郊土地复垦技术及种植豌豆培肥效果评价研究

以武汉市东西湖区城郊复垦土地为研究对象,设标准农用试验地作对照,比较分析复垦一年、复垦二年土壤改良情况,为我国城郊土地复垦提供技术方案和参考依据。采用人机结合方式清理复垦城郊土地表层(0~50 cm)建筑垃圾、水泥石块,卫星水平整地仪平整地块;根据土层特性回填沙土或湖泥、塘泥,调整复垦土壤酸碱度;种植豌豆还田培肥,增加土壤有机质含量,改善土壤环境和肥力状况。结果表明:回填沙土或湖泥、塘泥,复垦一年土壤pH值调整到7.5,复垦二年土壤pH值调整到7.0,基本接近对照试验地的土壤pH平均值6.7。种植豌豆对照试验地土壤的有机质含量值为168.40‰,复垦一年土壤的有机质含量值为15.10‰,复垦二年土壤的有机质平均含量值为195.06‰,肥力达到标准化农用地的水平。复垦二年试验地豌豆株高整齐度指标为11.93,接近试验对照地13.75,说明复垦地土壤经过二次改良,土壤环境与肥力状况得到明显改善,营养成分均一化程度高,基本达到标准化农用地的水平,可以实现转换耕种。

不同营养和培养条件对向日葵黑茎病菌生长特性的影响

【目的】对向日葵黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi生态适应性中的营养和培养条件进行研究,以期建立常规生物学检测方法,以便采取有效检疫处理措施。【方法】不同营养和培养条件下(包括培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照),对该菌培养7 d,测量其菌落直径大小和观察其生长状况。并用SPSS 12.0软件进行相应的计算处理、统计分析。【结果】向日葵黑茎病菌在PDA、HLA培养基上生长较好,在WA培养基上生长较慢。该病菌能充分利用可溶性淀粉和硝酸钾。在温度4～32℃均能生长,最适生长温度为24～28℃,适宜生长的pH 4.0～8.0,最适pH 5.0～7.0;在全光照培养条件下有助于菌丝的生长。【结论】通过不同营养和培养条件下的生长情况,可知该病菌的最适生长条件,有助于对该病菌进行有效的检疫处理。

两种植原体的PCR检测及其体系优化

用已报道的植原体通用引物对葡萄黄化病和枣疯病植原体进行常规PCR及巢式PCR检测,并对PCR反应体系进行优化。结果表明:常规PCR扩增出了1.5kb的特异片段,所需PCR模板DNA用量为20ng/μL;在PCR基础上的巢式PCR扩增出1.2kb的特异片段,所需PCR模板DNA用量为2pg/μL。检测灵敏度提高约10000倍。优化试验表明:25μL反应体系中,MgCl2用量对扩增效果影响最大。最终最佳反应体系确立为:25mM MgCl21.7μL,2.5mM dNTP1.8μL,5U/μL Taq酶可选用0.2μL,10mM引物对各0.2μL,最佳退火温度为45.0℃。

基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的葡萄卷叶伴随病毒3号检测方法

【目的】建立一种快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)方法。【方法】根据GLRaV-3已测序和已报道的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列,设计用于RPA检测的特异性引物,建立GLRaV-3的RPA检测方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。【结果】建立RPA检测方法能够从GLRaV-3带毒株中检测到约380 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,无需特殊的仪器设备,经特异性评价特异性好,且该方法与普通PCR检测灵敏度基本一致。【结论】建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合GLRaV-3的快速检测方法。

葡萄A病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此,开展针对GVA的反转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）研究,旨在建立其RT-LAMP特异性检测方法。【方法】通过比对分析GVA的CP（coat protein）基因序列并经引物设计软件Primer Explore 4.0设计,获得6条检测引物GVA-FIP（5′-CTTACAGCCACGCTCAGAGTCC-CGTGGGAAGTTGGTTGTGT-3′）、GVA-BIP（5′-GCCCGTCAAAGGGGCTACAC-TCATA GGCGTTCTGTGCGA-3′）、GVA-F3（5′-AGAAGATGGGGATAGACCCG-3′）、GVA-B3（5′-CCGCCATTAACACGAGGAA-3′）、GVA-LF（5′-AT CCTTCCCACCAGCTCGG-3′）和GVA-LB（5′-TCAGGCAGATGTGTGAACCT-3′）。将RT-LAMP的反应温度分别设为59、61、63和65℃,根据1 h扩增曲线出现的先后次序确定最佳反应温度。以同样侵染葡萄的沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPa V）、葡萄卷叶病毒（Grapevine leafrollassociated virus,GLRa V）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus,GFKV）的阳性材料及阴性对照（健康葡萄叶片,用NC表示）的总RNA为模板,对RT-LAMP方法的特异性进行测定。将GVA的总RNA进行10倍梯度稀释,得到10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6倍的不同稀释液后用作模板分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测,比较两者的灵敏度。RT-LAMP产物可进行实时扩增曲线检测,阳性样品在浊度仪上出现扩增曲线,阴性样品无扩增曲线;还可进行染料颜色反应检测,在反应产物中加入SYBR Green I染料,阳性样品产生肉眼可见的绿色,阴性反应为橙色。【结果】建立了GVA的RT-LAMP快速特异性检测方法,最佳反应温度为65℃。该方法约27 min即可检测到扩增曲线,而普通RT-PCR获得检测结果约需1.5 h。特异性试验表明只有GVA的总RNA能够出现扩增曲线,反应液颜色变为绿色,显示为阳性,而其他3种参试病毒和健康对照没有出现扩增曲线,反应液的颜色为橙色,显示为阴性;RT-LAMP检测结果可通过肉眼观察直接判断,比普通RT-PCR结果判断容易。灵敏度试验显示RT-LAMP可检测到10^1、10^2、10^3、10^4和10^5倍的GVA总RNA稀释液模板,而普通RT-PCR只能检测到10^1、10^2、10^3和10^4倍的GVA总RNA稀释液模板,表明前者比后者的灵敏度高10倍。【结论】研究建立的RT-LAMP方法能够快速特异地检测GVA,可为筛选无GVA葡萄苗木提供技术支持;适用于检疫、科研及生产机构在进境检疫、苗木繁育和大田监测工作中对GVA的检测鉴定。

基于DPO引物的实时荧光PCR检测微生物肥料中的鼠李糖乳杆菌

【目的】建立一种快速、准确的鼠李糖乳杆菌检测方法。【方法】根据已报道的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的gyr B基因保守序列,设计用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性DPO引物,结合SYBR Green I实时荧光PCR技术,建立鼠李糖乳杆菌的实时荧光PCR检测方法,评价其特异性和灵敏度,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。【结果】该方法对2株鼠李糖乳杆菌能得到阳性扩增,而其余10种乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,而且在退火温度为50~60℃不影响其特异性;该实时荧光PCR检测灵敏度比农业部标准中普通PCR检测高10倍;用10种微生物肥料及其它益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。【结论】研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够准确、高效的检测微生物肥料及其他益生菌产品中的鼠李糖乳杆菌。

一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增(RT-RPA)技术检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,简称BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物,建立快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,简称RT-RPA)技术用于对BPMV的检测。根据BPMV基因组的保守序列,设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)技术特异性引物,对BPMV、南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,简称SBMV)、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,简称SMV)、南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,简称Ar MV)及烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,简称TRSV)共5种病毒进行RT-RPA特异性验证;并设计5个模板浓度梯度,以验证RT-RPA方法的灵敏性。结果表明,建立的RT-RPA检测方法能够从BPMV样品中检测到198 bp的特异性条带,且仅需在40℃下恒温反应40 min,不需要特殊的仪器设备;特异性验证试验表明,除BPMV能检测到特异性条带外,其他4种病毒SBMV、SMV、Ar MV、TRSV均未检测到特异性条带,证明该方法特异性好; RT-RPA检测BPMV的灵敏度达到10-4稀释度,说明所建立的RT-RPA方法灵敏性高。综上所述,建立的RT-RPA方法检测BPMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

甜菜霜霉病菌形态鉴定及28S rDNA序列分析

【目的】利用形态学和分子生物学技术,对新疆甜菜霜霉病进行鉴定和基因序列分析。【方法】挑取甜菜叶片上霉层,对孢囊梗及孢子囊进行显微观察;提取甜菜霜霉病菌DNA,用卵菌纲通用引物NL1/NL4进行PCR扩增、序列测定、同源性比较。【结果】显微观察到的病原菌孢囊梗及孢子囊与已报道的甜菜霜霉病菌形态一致;PCR扩增28S rDNA末端序列为801 bp,Genbank比对结果显示该段序列与霜霉属粉霜霉菌(Peronospora farinose)最为接近,同源率在99%以上,与霜霉属主要典型株系同源性均在90%以上。【结论】显微形态观察和分子生物学鉴定结果一致,该病原菌属霜霉属,粉霜霉。

应用实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌

【目的】建立用于快速检测甜菜霜霉病菌Peronospora farinosa f.sp.betea Byford的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。【方法】根据已报道的P.farinosa f.sp.Betea Byford及近似种28S r DNA序列同源性比对结果,设计用于检测甜菜霜霉病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测引物。利用所建立的方法对包括P.farinosa f.sp.Betea在内的6种甜菜上的病原菌和5种其他霜霉病菌基因组DNA及12份甜菜种子样品进行检测,验证该方法的检测特异性、灵敏度及实用性。【结果】所建立的检测方法仅对甜菜霜霉病菌得到阳性扩增,其它参照菌株及阴性对照均无荧光信号扩增,准确排除了甜菜上其他5种病菌的干扰,其检测灵敏度显示最低限量为100 fg病菌DNA,应用该方法对不同来源的12份甜菜种子样品进行检测,田间监测结果一致。【结论】所建立的荧光检测方法能够对甜菜霜霉病菌进行快速筛查,为甜菜霜霉病菌的早期诊断和防控提供了一种技术手段。

引起葡萄黄化类症状的病毒和类病毒RT-PCR检测

【目的】明确引起新疆葡萄黄化类症状的病毒及类病毒种类,分析其单病毒和复合感染情况,为葡萄病毒及类病毒的防治提供重要的理论依据和有效的检测技术。【方法】利用已报道的6对特异性引物(GRSPa V-RSP48/49、GFKV-L630/U279、GLRav2-V2d CPf2/V2CPr1、HSVd-f/r、GYSVd1-f1/r1和GYSVd2-f2/r2)分别对新疆不同地区黄化类症状的葡萄病样进行RT-PCR检测,并对各引物的扩增产物进行序列分析。【结果】3种病毒及3种类病毒(GRSPa V、GFk V、GLRa V-2、GYSVd2、GYSVd1和HSVd)在新疆葡萄中均有不同程度的感染,其感染率分别为36.1%、51.4%、48.6%、37.5%、37.5%、94.4%;72个病样中,2种以上病毒或类病毒复合感染率约为75%,6种病毒或类病毒复合感染率为10%以上。【结论】可侵染新疆葡萄引起黄化类症状的病毒和类病毒可达6种,且复合感染较为普遍。

一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增技术(RT-RPA)检测大豆花叶病毒

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是一种在全世界广泛分布并且破坏性极大的植物病毒,可以导致大豆产量骤减以及种质的衰退,为此,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),利用该技术可以快速、准确、有效地检测大豆中携带的SMV。根据Gen Bank数据库中SMV的外壳蛋白基因序列,设计RPA特异性引物,采用SMV、BPMV、SBMV、Ar MV及TRSV共5种病毒进行RT-RPA特异性验证;并设计5个模板浓度梯度,验证RT-RPA方法的灵敏性。结果显示,建立的RT-RPA检测方法能够从SMV样品中检测到154 bp的特异性条带;特异性验证试验表明除SMV能检测到特异性条带以外,其他4种病毒BPMV、SBMV、Ar MV及TRSV均未检测到条带;RT-RPA检测SMV的灵敏度达到10-4稀释度。综上所述,本研究建立的RT-RPA方法检测SMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

紫色辣椒新品种‘江大紫椒1号’

‘江大紫椒1号’是以自交系P-9-2-5-1为母本,紫-11-2-1为父本配制而成的辣椒一代杂种。植株长势强,中熟;幼果为绿色,商品果为紫色、羊角形,果长19.84 cm,果肩宽2.9 cm,果肉厚2.8 mm,单果质量56.99 g;维生素C含量625.2 mg·kg^(-1),花色苷含量44.6 mg·kg^(-1)。果实微辣,鲜食菜用,平均产量为45 840 kg·hm^(-2);适宜湖北平原地区春季和秋季保护地栽培。

利用小RNA深度测序技术从新疆葡萄上检出8种病毒

Kreuze et al（.2009）发现病毒特异的小RNA（small RNA,sRNA）为多拷贝的重叠序列,推测可通过深度测序技术获得病毒的大量sRNA序列,经拼接和比对分析后能高效鉴定病毒种类。目前,利用sRNA深度测序技术已在作物和昆虫上发现多种病毒（Liu et al.,2011;He et al.,2015）。2013年本课题组在葡萄病害调查过程中发现,伊犁州部分地区的葡萄在种植4-5年后,叶片黄化、变小,整个植株矮化.

南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

两种向日葵检疫性真菌病害的多重DPO-PCR检测方法

本研究根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列,向日葵黑茎病菌的ITS-5.8S r RNA基因序列,分别设计特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立同时检测这两种检疫性病菌的多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌可分别扩增出307 bp与388 bp的特异性条带,其他参照菌株及阴性对照均无条带;检测体系对混合模板中向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的DNA灵敏度均达0.05 ng/μL;且该检测方法对退火温度不敏感,适用范围广。该方法能够准确、快速的检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌,适合于口岸实验室的快速检测。

基于DPO引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶伴随病毒3号

葡萄卷叶病是葡萄上一种重要的病毒病,在国内分布较为普遍,引起该病的葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV）是由多种病毒单独或复合侵染造成。已报道的GLRaVs至少有5种,其中GLRaV-3是葡萄卷叶病毒属Ampleovirus典型成员（Ling et al.,2004）。