四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物(油菜、大豆、花生和芝麻)中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域(BOX I-IV)和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1,Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因通常含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜Bn-Actin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高(接近大豆GlymaActin的2%),Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。

甘蓝型油菜分枝数QTL定位及其候选基因预测

分枝数是影响油菜产量的重要株型性状之一.为了有助于油菜分枝数的分子标记辅助育种,以甘蓝型油菜品系888-5（多分枝）和M083（少分枝）杂交形成的重组自交系（RIL）群体为材料,通过利用第一张油菜60KSNP芯片对群体进行高通量SNP分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对RIL群体在4个环境（武汉-2012、武汉-2013、扬州-2012和扬州-2013）下分枝数进行QTL定位.结果表明：共检测出18个分枝数QTL,分布于A2、A6、A7、C1和C4连锁群.其中11个QTL在2个以上环境下可重复检测到;有2个QTL与环境之间存在互作效应.主效QTL2个（qBN2-3和qBNE2-1）,分别在3个、4个环境下重复检测到,可解释的表型变异为13.12% ～20.60%,2.80% ～30.10%.qBNE2-1与环境存在互作效应.另外,通过利用SNP标记侧翼序列和油菜基因组比对作图,从3个QTL（qBN2-1、qBN7-6和qBN7-8,三者可解释的表型变异分别为19.40% ～17.30%、5.70% ～12.21%和7.88% ～10.32%）的基因组区段内（分别为279kb、165kb和562kb）共筛选出4个与分枝数有关的候选基因,它们的拟南芥同源基因（分别为CUC2、PIN3、F23N20.8和PIN4）均参与拟南芥分枝数的分化或形态建成.

芝麻EST-SSR引物的开发与应用

为丰富芝麻EST-SSR引物,本研究从实验室构建的高油芝麻品系中芝14号的不同种子发育期cDNA文库中获得45 569条表达序列标签(expressed sequence tags,EST),通过前处理得到总长17.428Mb的无冗余EST共32 421条。利用MISA和SSR finder软件包工具对EST序列进行SSR位点查找,在这些序列中发现有1 688条Unigene,共有1 949个SSR。共226个序列含2个或2个以上SSR位点。这些SSR中出现频率最高的重复基序类型为三核苷酸(74%)。为开发芝麻EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于芝麻品种遗传差异研究的可行性,用12份不同含油量品系材料评价其中34对与油脂代谢相关的基因SSR引物,全部成功扩增,共有3对引物获得多态性条带。结果表明,芝麻EST-SSR标记开发效率较高,对于芝麻品种的鉴定与遗传多样性分析具有很高的应用价值。

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因(负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因)家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM(隐马尔科夫)模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。

芝麻种质资源信息数据库的设计与构建

农作物种质资源信息的数据建设对品种改良至关重要。本研究对我国收集保存的8 115份芝麻种质资源的基本信息、形态特征和生物学特性、品质特性、抗性等数据进行规范整理,以90 420条芝麻信息为数据来源,采用LMAP数据库技术构建了在线芝麻种质资源信息数据库http://www.sesame-bioinfo.org/phenotype/index.html。数据库主要功能包括芝麻种质资源信息浏览、信息检索及实物索取。本数据库的创建打破了传统纸质或综合性数据库存储芝麻种质资源信息的局限,有效解决芝麻种质资源数据保存分散,共享、交流、利用困难等问题,实现了芝麻资源数字化管理和交流,将极大促进资源的有效利用。

芝麻发芽期耐盐性鉴定方法研究及耐盐候选基因的挖掘

【目的】确定芝麻发芽期耐盐性鉴定适宜的Na Cl胁迫浓度和评价指标,发掘耐盐种质和耐盐相关重要基因,为芝麻耐盐性大规模鉴定、遗传改良和耐盐机理研究提供方法借鉴和优异基因资源。【方法】以8份耐盐性差异较大的芝麻种质为材料,在不同浓度的Na Cl(0、50、100、150、200和250 mmol·L-1)胁迫下发芽,测定其发芽势、成苗率、根长、芽长和鲜重等指标,通过对指标值的方差分析、主成分分析、隶属函数和相关性分析等,筛选芝麻发芽期耐盐性鉴定适宜的Na Cl处理浓度和评价指标。以100 mmol·L-1 Na Cl溶液为处理浓度,相对成苗率为鉴定指标对71份芝麻核心种质进行发芽期耐盐性鉴定和全基因组关联分析,并对获得的候选基因进行功能注释;通过Na Cl胁迫下芝麻幼苗叶片转录组测序和荧光定量PCR分析候选基因的表达模式,筛选耐盐相关候选基因。【结果】对不同浓度Na Cl胁迫下8份芝麻材料发芽各指标进行统计和方差分析表明,100 mmol·L-1的Na Cl处理下,除发芽势外,发芽指数、活力指数、成苗率、根长、芽长和苗鲜重的标准偏差值均较大,所有指标在0.05水平上均存在显著差异,100 mmol·L-1的Na Cl溶液可以作为芝麻发芽期耐盐性鉴定的适宜胁迫浓度;相对成苗率、相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数、相对芽长、相对根长和相对鲜重7个指标与芝麻发芽期耐盐性关系密切,贡献率较高,可以作为芝麻发芽期耐盐性鉴定的评价指标。71份芝麻核心种质材料的相对成苗率变异比较丰富,符合正态分布;通过对71份芝麻核心种质相对成苗率与SNP标记进行全基因组关联分析,检测到7个与芝麻发芽期耐盐性显著关联的SNP标记(LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301),SNP标记上、下游各100 kb区间内共有基因67个,其中有功能注释的基因34个;通过耐盐材料S04在盐胁迫下的转录组测序和荧光定量PCR对预测的候选基因进行表达模式分析,共有21个候选基因受到盐胁迫诱导显著差异表达。【结论】芝麻发芽期耐盐性鉴定的适宜Na Cl胁迫浓度为100 mmol·L-1,相对成苗率等7个指标可以作为适宜的评价指标;检测到与芝麻发芽期耐盐性显著关联的SNP标记7个,并鉴定出耐盐候选基因21个。

甘蓝型油菜株高性状的全基因组关联分析

适当的株高不仅是抗倒性和机械化收获的需要,而且是建立高产理想株型的需要。本研究测定来自世界油菜主产国的371份种质资源材料构成的自然群体的株高,利用60K SNP芯片对该群体进行基因型检测,获得了21 856个SNP,利用这些SNP和株高数据进行全基因组关联分析,结果表明:(1)检测到4个与株高显著关联的SNP,即Bn-A07-p3583161、Bn-scaff_22790_1-p1271170、Bn-scaff_20735_1-p42779和Bn-scaff_18702_1-p589589,分别分布于A07、C01和C02染色体;它们对表型变异的解释率分别为11.33%、11.75%、12.31%和10.97%;(2)参考基因组信息,在上述前3个SNP附近的492.0、9.5和69.5 kb处分别找到一个与株高性状相关的候选基因;(3)4个显著SNP各自的等位基因间表型均值差异分别为11.09、15.12、10.48和8.93 cm,双尾t测验结果表明各等位基因组间差异显著。

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶基因BnCP51及其启动子的克隆与表达

为通过转基因技术建立新型授粉控制体系,克隆与雄性不育相关的基因及启动子,根据甘蓝型油菜全基因组信息设计特异引物,获得半胱氨酸蛋白酶家族基因Bn CP51的完整开放阅读框和上游启动子序列。Bn CP51基因全长1 032bp,在Gen Bank登录号KC898325,启动子长1 951bp。生物信息学分析表明,Bn CP51具有木瓜蛋白酶基因家族典型的保守结构域ERFNIN和GCNGG功能域。实时荧光定量PCR结果表明Bn CP51在花蕾中高量表达。在线启动子序列元件预测分析发现Bn CP51启动子序列中有多个花药特异表达元件。构建重组载体p Bn CP51::GUS,转化拟南芥,GUS染色结果表明在Bn CP51启动子的驱动下,报告基因GUS仅在中期花蕾和花药中特异表达,在其他组织中不表达。

不同菌核病抗性甘蓝型油菜中BnVRN2基因的克隆与表达

为了探索甘蓝型油菜开花期与菌核病抗性的关系,以甘蓝型油菜M083(抗病、晚花)和888-5(感病、早花)品系为材料对开花相关基因Bn VRN2进行克隆;对2个品系中Bn VRN2序列差异及核盘菌诱导前后的表达水平差异进行分析。结果显示,在甘蓝型油菜中Bn VRN2基因存在2个拷贝,分别命名为Bn VRN2a(位于A8染色体)和Bn VRN2b(位于C8染色体),Bn VRN2a在抗/感品系中存在序列差异,而Bn VRN2b则不存在。Bn VRN2a在M083和888-5中的CDS全长分别为1 278bp、1 284bp,分别编码425、427个氨基酸残基;2个品系中Bn VRN2a基因的CDS序列存在着12个SNP变异位点以及一个6bp的插入/缺失片段;核苷酸序列的差异导致了蛋白质序列7个氨基酸的改变,且第100位氨基酸变异存在于两者的锌指结构域中。Bn VRN2a基因在菌核病诱导前后,在M083和888-5中的表达水平都存在差异,初步推测该基因在甘蓝型油菜开花相关途径和菌核病防御反应中都起到一定的作用。

芸薹属AC基因组中VIT基因家族的鉴定与进化

为了解液泡铁离子转运蛋白(vacuolar iron transporter,VIT)编码基因在芸薹属作物中的进化关系,在已完成的拟南芥、白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜全基因组测序基础上,利用HMMER软件根据VIT保守的结构域对拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组的蛋白质序列进行同源检索,在四个物种中分别鉴定得到了9个、13个、12个和14个VIT候选基因;并且系统发育分析显示,VIT基因家族在四个物种可分为3类。VIT基因的启动子区域富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件。蛋白质特性分析结果表明VIT结构域中具有多个保守的疏水氨基酸位点。表达谱分析显示所有VIT基因在所选取的组织中都有不同程度的表达。同时,线性对应的同源基因表达模式既有相似之处,又存在分化,而串联重复基因簇表达模式基本一致。

芝麻赤霉素合成相关基因鉴定与表达分析

赤霉素的生物合成是多种酶促反应的过程,与植株发育、逆境响应密切相关。为分析芝麻基因组中赤霉素合成相关基因的分布、结构和活性特征,本研究以芝麻基因组序列和不同组织转录组为对象,通过生物信息学方法,从中共鉴定出32个赤霉素合成相关基因,分属7个不同的基因家族,分布在除5号染色体外芝麻所有的染色体上。不同基因家族蛋白质肽链长度存在较大差异,其中CPS家族的蛋白质序列最长,平均包含776个氨基酸残基;KAO家族蛋白序列长度的变异最大,在401~834个氨基酸之间。所有芝麻赤霉素合成相关基因编码的蛋白质预测为亲水性蛋白。与拟南芥、水稻、大豆、葡萄、高粱、番茄等物种相比,芝麻中赤霉素合成相关基因数目处于中等水平,但CPS家族中芝麻的基因数目明显多于其他物种,进化分析表明,在分析的7个物种中,芝麻与番茄具有较近的进化关系。在不同组织中,7个相关基因家族表达模式不同。KS家族基因在种子、茎尖和叶片中表达相对较高;CPS家族基因在心皮和种子中活性较强,但在茎尖和叶片中几乎没有表达;KAO和KO家族基因在不同组织中整体上具有相对较高的活性,而KS、GA3ox家族的基因在不同组织中整体表达量较低。就不同组织而言,种子中的GA合成相关基因活性整体较高;而在根尖、茎尖、叶片等与芝麻植株形态建成密切相关的3个组织中,这些基因表达以根尖较突出、其次为茎尖,在叶片中的活性整体较低。本研究为解析芝麻赤霉素合成相关基因的结构特征及其在不同组织中的作用特点提供了基因信息和理论参考。

油菜抗菌肽基因BnLTP1的克隆表达及活性

为研究转脂蛋白(lipid transfer protein,LTP)作为抗菌肽在油菜防御反应中的作用,利用生物信息学的方法,从油菜中筛选获得了一个转脂蛋白类抗菌肽基因,命名为Bn LTP1。Bn LTP1基因长度为93bp,编码31个氨基酸残基。抗菌肽Bn LTP1分子量约为3.4k Da,其序列中的4个半胱氨酸形成两个分子内二硫键,对于稳定抗菌肽的结构起到至关重要的作用。通过overlap PCR的方法对该基因进行体外人工合成,并克隆到p ET30a/His-EDDIEGFP表达载体上进行体外原核表达。抑菌活性实验检测发现,Bn LTP1对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌都有较强的抑菌活性;对植物病原真菌(核盘菌、灰霉菌和稻瘟病菌)等也具有抑菌活性。

抗菌肽基因BnPCD842895克隆表达及活性检测

为寻找新型植物抗菌肽,通过生物信息学的手段在全基因组范围内进行油菜抗菌肽基因的预测和分析,初步筛选出与已知抗菌肽具有类似序列结构特征的候选基因BnPCD842895。BnPCD842895基因长度为189bp,编码48个氨基酸,通过overlap PCR方法,将合成的抗菌肽基因克隆到pET30a-EDDIE-GFP表达载体上。将大肠杆菌中表达得到的包涵体融合蛋白在体外复性,并通过融合蛋白EDDIE的自我剪切,从而获得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽产物。抑菌活性检测结果表明BnPCD842895对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有较强的抑菌活性。

甘蓝型油菜RabGDI3基因启动子的克隆和功能验证

以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)基因组DNA为模板扩增获得BnRabGDI3基因翻译起始位点上游2 064bp的启动子序列。在线预测分析发现该启动子序列中有很多花药特异表达元件。将克隆得到的BnRabGDI3启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnRabGDI3启动子驱动报告基因gus表达的双元载体pBnRabG-DI3::GUS,并用根癌农杆菌介导法转化拟南芥。对获得的含有报告基因gus的6个转基因株系进行GUS活性分析。结果表明,在BnRabGDI3启动子的驱动下,报告基因gus仅在花药中特异表达。花药的冰冻切片显示gus仅在花药发育的第11到13期有表达,在花药的双核和三核期小孢子细胞中表达量最高。实验结果暗示BnRabGDI3基因可能与小孢子的发育相关。

萝卜抗菌肽基因Rs对菌核病的抗性

为分析萝卜抗菌肽Rs是否对核盘菌具有抗性,人工合成了Rs基因,并利用水稻α-淀粉酶信号肽αAmy3SP引导目的基因在胞间隙和质体表达的作用特点,通过基因重组技术构建植物表达载体p35S-SP-Rs,同时构建了p35S-SP-GFP载体,基因枪轰击洋葱表皮。实验发现荧光信号主要存在于植物细胞的细胞壁和细胞膜之间,说明在35S和信号肽αAmy3SP的引导下GFP在细胞间隙中有效表达。采用浸花法将植物表达载体p35SSP-Rs转入拟南芥中,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得35株Rs转基因阳性植株。qRT-PCR显示Rs基因在转基因拟南芥中的表达水平得到显著提高,而植株的生长发育未受影响。抗病鉴定结果显示,转基因植株对菌核病的抗性显著增强。结果说明通过在细胞间隙中高量表达抗菌肽Rs,在避免对细胞产生毒性的同时,显著抑制了核盘菌菌丝的扩展,从而达到抗病目的。

微生物菌剂拌种对青贮玉米根际微生物群落结构的影响

试验旨在研究微生物菌剂对玉米根际土壤微生物群落结构的影响。选择适合河北省种植的青贮玉米品种,设置拌种试验组和对照组,并于青贮玉米不同生长周期采集根际土壤进行高通量测序。结果显示,试验组和对照组东单1331品种3个生育时期的18个土壤样品,共得到706 878条有效序列、6 751个OTUs,注释到24门、57纲、75目、160科、389属、465种。试验组和对照组的绝对优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria),且不同处理条件下各优势菌门的相对丰度存在差异性。试验组和对照组的优势菌属为鞘氨醇菌属(Sphingobium)、小双孢菌属(Microbispora)、芽单胞菌属(Gemmatimonas),且属水平上各处理组的细菌群落结构差异较大。与对照组(CK)相比,试验组东单1331的产量、品质明显提高,土壤营养和土壤微生物群落结构明显改善。研究表明,试验结果可为推广应用高产、优质青贮玉米拌种方式和栽培方式提供参考。