毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失对肠炎沙门菌形态、毒力和免疫原性影响的研究

沙门菌毒力岛基因SPI-1和SPI-2分别编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的T3SS-1和T3SS-2,T3SS可以将沙门菌分泌的效应蛋白转运至宿主细胞中。为分析毒力岛基因SPI-1和SPI-2缺失对肠炎沙门菌生物学特性、致病性和免疫原性的影响,本实验室前期构建了肠炎沙门菌SM6株毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失株(SM6ΔT3SS),本研究通过绘制亲本株和缺失株的生长曲线,采用扫描电镜观察二者的形态,并测定二者对人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)的黏附性与侵袭力。生长曲线结果显示,培养5 h时,SM6ΔT3SS株的生长速度显著快于亲本株SM6(P<0.05),自6 h起SM6ΔT3SS株的生长速度极显著快于SM6株(P<0.01)。扫描电镜观察可见,亲本株菌体多单个存在,而缺失株则出现明显的菌体聚集,且其表面被类似胶状物包裹。黏附性与侵袭力结果显示,与亲本株SM6相比,缺失株SM6ΔT3SS黏附及侵入Caco-2细胞的数量均极显著下降(P<0.001、P<0.001)。上述结果表明,毒力岛基因SPI-1和SPI-2的缺失可能改变了细菌的生长、代谢、分泌及或结构等特征,导致沙门菌的生物学特性的改变及降低了其对肠上皮细胞的黏附性和侵袭力。以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射感染7日龄SPF鸡,并于感染后不同时间检测缺失株在SPF鸡盲肠、肝脏和脾脏的载菌量;将缺失株以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射免疫7、21和35日龄鸡,在首免后不同时间采血,采用间接ELISA检测各组鸡血清中的IgG抗体水平;在首免后42 d时经腹腔注射1×10^(9)cfu/100μL/只的沙门菌SM6株,并于攻毒后7 d和14 d采血连同免疫期间采集的血一起采用间接ELISA检测各组鸡血清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。在攻毒后14 d内观察并统计各组鸡的临床症状及死亡率。攻毒后7 d各组均剖杀部分鸡,采集其盲肠和肝脏组织制备病理切片观察各组织病理变化,评价该缺失株的免疫效力。载菌量结果显示,感染后2 d,缺失株在鸡脾脏和肝脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.001),但在盲肠中的载菌量极显著高于亲本株(P<0.01);感染后4 d,缺失株在肝脏和盲肠中的载菌量极显著和显著低于亲本株(P<0.01、P<0.05);感染后8 d,缺失株在脾脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.01),且两组鸡在上述脏器中的载菌量均降至较低水平;抗体和细胞因子的ELISA检测结果显示,首免后14 d,免疫组鸡的抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。从免疫后21 d,免疫组鸡的抗体水平均极显著高于对照组鸡(P<0.001);免疫期血清中IFN-γ的分泌水平无明显变化,IL-4的含量在免疫后42 d极显著高于对照组(P<0.01);攻毒后鸡血清中IFN-γ和IL-4的含量均显著高于对照组(P<0.05)。整个实验期SM6ΔT3SS免疫组鸡均存活且无明显的临床症状、无死亡,肝脏和肠黏膜仅出现轻微病理损伤,对照组鸡组鸡攻毒后14 d内死亡率达80%,肝脏和肠黏膜均出显较明显的病变。上述结果表明,SM6ΔT3SS株能够刺激SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫反应,对SPF鸡的致病性降低,并对鸡有较好的免疫保护效力。本研究为阐明沙门菌致病机制和研发安全有效的沙门菌减毒活疫苗奠定了良好基础,也为沙门菌病的防控提供了新思路。

旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定

根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBRGreen染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况。制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况。结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期。天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫。表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性,该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关。

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)793/BS1基因序列,设计1对引物,扩增891bp特异性核酸片段,建立了检测IBV793/B的RT-PCR方法。特异性试验结果表明,IBV793/B能扩增出891bp的核酸片段,而IBVM41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT-PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793/B进行检测,结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793/B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。

旋毛虫虫体蛋白对肝癌细胞H7402的抑制作用

目的:研究旋毛虫虫体蛋白对肝癌H7402细胞的抑制作用,确认其对肝癌细胞的抗肿瘤活性。方法:通过体内、体外培养获得旋毛虫成虫与新生幼虫的混合物,采用匀浆、离心方法制备旋毛虫虫体蛋白,紫外分光光度计检测蛋白浓度。分别设0.035、0.070、0.140 mg/ml与H7402细胞作用为实验组,并设虫体蛋白对正常肝细胞HL-7702细胞作用为对照组,采用MTT检测细胞增殖能力,划痕实验、侵袭实验检测旋毛虫虫体蛋白对H7402的迁移及侵袭能力的影响,采用TUNEL法和流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡和细胞周期。结果:成功制备了旋毛虫虫体蛋白。0.035、0.070、0.140 mg/ml旋毛虫虫体蛋白对H7402细胞增殖的抑制率分别为(22.40±13.80)%、(29.45±16.80)%、(39.38±17.80)%。TUNEL实验和流式细胞术可观察到旋毛虫虫体蛋白诱导H7402凋亡,其凋亡率为(39.07±0.90)%,细胞周期阻滞于S期。划痕和侵袭的实验表明旋毛虫虫体蛋白对H7402细胞迁徙能力有抑制作用,对其侵袭的抑制率为(63.79±13.71)%。结论:旋毛虫虫体蛋白对肝癌H7402细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用,可能是一个有潜在应用价值的抗肝癌生物制剂。

副猪嗜血杆菌菌影的制备

为研制副猪嗜血杆菌(H.parasuis)菌影疫苗,本实验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将其连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,使裂解基因E与λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。并将含有E基因的裂解盒插入pMD18-T载体中,构建H.parasuis打孔质粒(pMD-E)。采用电击穿孔法将其转入E.coliβ2155中,利用接合的方式将打孔质粒转入H.parasuis 5型菌株中。将含有打孔质粒的H.parasuis在28℃培养至对数生长期,升温到42℃诱导E基因表达,制备H.parasuis菌影。电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。本实验为进一步研究菌影疫苗奠定了基础。

噬菌体展示技术及其应用

噬菌体展示技术是一项新兴的分子生物学技术;该技术将基因型和表现型有效地联系起来,是后基因组时代的有力工具。目前用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体;它们所展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用,并显示了良好的应用前景。

肠炎沙门菌延伸因子EF-Tu缺失株对环境压力的应答变化

延伸热不稳定因子(EF-Tu)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸。为研究肠炎沙门菌EF-Tu的tuf A基因缺失对环境压力的应答变化,本研究利用改进的Red同源重组方法构建肠炎沙门氏菌SM6株的tuf A缺失株,命名为SM6Δtuf A,并鉴定缺失株的形态学变化,分析耐酸性、渗透应力、温度缺氧应力、氧化应力的改变。结果表明缺失株对酸性条件及升温缺氧的耐受与亲本株相似;对渗透压的耐受稍强于亲本株,但差异不显著;对氧化压力的耐受显著弱于亲本株。本研究构建的肠炎沙门氏菌tuf A基因缺失株SM6Δtuf A,为进一步研究EF-Tu在沙门氏菌的生物学和致病机制中的作用奠定了基础。

犊牛瘤胃干酪乳杆菌分离鉴定及其耐酸相关基因ffh的克隆

利用乳酸杆菌分离培养基(SL)对犊牛瘤胃内的乳酸杆菌进行分离,对分离出的乳酸杆菌进行革兰氏染色、生化反应及16S rRNA同源性分析鉴定。对分离鉴定的干酪乳杆菌提取其基因组,根据Genbank发表的干酪乳杆菌耐酸相关基因(ffh基因)设计1对引物进行PCR,利用pMD18-T载体进行克隆,构建重组质粒,进行PCR及测序鉴定,获得耐酸基因ffh,为下一步研制瘤胃微生态制剂及构建瘤胃内耐酸的乳酸分解基因工程菌奠定了基础。

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV793/B血清型发表的血清型特异性引物经RTPCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型。

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。

禽源奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了鉴定哈尔滨地区某养殖场发生的一起细菌感染的致病菌,试验对送检病料进行病原菌的分离培养和形态学观察,并应用微生物自动分析系统和PCR方法鉴定菌株,再对分离菌进行生化试验和药敏试验。结果表明:该病原菌为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis),对恩诺沙星、丁胺卡那霉素和β-内酰胺类药物高度敏感。

旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定

采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11～14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6～13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14～20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。

大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D缺失株,命名为BL21Δsly D;并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明,缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著,然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株(p<0.01),表明大肠杆菌PPIases sly D基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌sly D基因缺失株BL21Δsly D为进一步研究大肠杆菌sly D基因的功能奠定了基础。

伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库的构建及筛选

目的获取伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)肌幼虫时期抗原性基因。方法利用λZAP载体构建伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库;以感染伪旋毛虫60天后的猪血清为抗体探针,对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫学筛选,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析。结果构建的伪旋毛虫cDNA表达文库的库容量为0.55×106pfu,重组率为95.6%,扩增后文库滴度为1.2×1010pfu/mL。从2.0×105个重组噬菌体筛选获得阳性克隆27个。序列分析结果表明这27个阳性克隆共编码7种cDNA分子,其编码的类似蛋白分别为伪旋毛虫Tp21kDa蛋白、伪旋毛虫Tp28kDa蛋白、蛋白酶体激活因子亚单位(Proteasome activator subunit)类蛋白、Nudix水解酶(Nudix hydrolyase)类蛋白、凝集因子(Condensin)类蛋白、尿嘧啶糖基化酶(uracil glycosylase)类蛋白和一个未知蛋白。结论获得两个反应原性较强且高拷贝的抗原基因,其分别编码Tp21kDa蛋白及蛋白酶体激活因子亚单位。

猪胸膜肺炎放线杆菌脂多糖的制备及对小鼠的免疫保护作用

采用酚-水法制备血清3型、4型、5型、7型和8型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)脂多糖(LPS),以该多糖免疫小鼠,进行同源攻毒保护试验,结果LPS在20μg/只的免疫剂量下可对小鼠产生较强的保护作用,用同血清型菌株对免疫后的小鼠攻毒,仅表现肺脏轻微出血,无死亡,而对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血;小鼠免疫后第2d就可以检测到抗体,并且抗体水平上升较快,到第6d抗体达到最高水平,之后,抗体水平开始下降,但下降幅度不大,可持续2个月左右;交叉保护试验结果表明血清3型LPS对血清5型和7型APP,血清4型LPS对血清5型和7型APP没有保护作用,免疫后的小鼠攻毒仍表现多数死亡;血清3型LPS对血清4型和8型APP有交叉保护作用,血清4型LPS对血清3型和8型APP有交叉保护作用,血清5型、7型、8型LPS对5个血清型的APP都有交叉保护作用,免疫后的小鼠攻毒无死亡,仅表现肺脏有不同程度的出血。上述结果表明LPS是APP的主要免疫保护性抗原之一,该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。

华支睾吸虫成虫虫体与排泄-分泌物抗原在ELISA检测中的评价

目的:探讨华支睾吸虫成虫可溶性抗原和排泄-分泌物抗原ELISA检测的临床诊断价值。方法:分别以虫体可溶性抗原和排泄-分泌物抗原作为诊断抗原,采用间接ELISA检测方法检测感染者(来自流行区,粪便虫卵检测阳性)血清107份和健康人(来自非流行区,粪便虫卵检测阴性)血清50份,计算其敏感性、特异性和符合率,并进行两种诊断抗原间的统计学比较与评价。结果:可溶性抗原的敏感性为58.88%,特异性为98%,符合率为71.34%;排泄-分泌物抗原的敏感性为87.85%,特异性为100%,符合率为91.72%。经统计学分析,两者敏感性和符合率差异具有统计学意义(P<0.05)。特异性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:作为诊断抗原,排泄-分泌物抗原优于可溶性抗原。排泄-分泌物抗原具有较高的敏感性与特异性,对于华支睾吸虫感染具有较高的诊断价值。

基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到pET-28a和pUC19载体中,构建重组质粒pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况。结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体菌中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达。本研究构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型原核细胞表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台。

旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定

目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star(DE3)后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。