高效液相色谱-示差折光法测定NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇含量

目的 建立测定NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇含量的高效液相色谱-示差折光法。方法 检测器为示差折光检测器,色谱柱为SUGAR SC1011阳离子钙型交换柱(300 mm×8 mm,6μm),流动相为纯化水,流速为1.0 mL/min,柱温为80℃,检测池温度为37℃,进样量为10μL。结果 甘露醇的质量浓度在0.02~5.00 mg/mL(R2=1.000 0,n=6)范围内与峰面积线性关系良好;定量限为13.37μg/mL;精密度、重复性、稳定性试验结果的RSD均小于2.0%;加样回收率为97.76%,RSD为0.97%(n=9)。3批小试样品和中试样品中甘露醇的含量分别为20.02,19.95 mg/mL。结论 该方法操作简便、重复性好、结果准确,可用于NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇的含量测定。

GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。

PICC置管引起机械性静脉炎的护理

目的：为肿瘤化疗患者建立良好的静脉通路，减少PICC置管引起的机械性静脉炎，提高癌症患者生活质量。方法：选择2004年3月～2007年3月，158例接受PICC置管术化疗的患者，对PICC置管术引起的机械性静脉炎进行观察。结果：14例发生机械性静脉炎，发生率8．86％（14／158）。结论：为避免肿瘤患者留置PICC导管引起的静脉炎，应早发现，及时进行护理干预和对症处理，最大限度地减少或减轻不良反应的发生，使患者顺利完成化疗，提高生活质量。

超抗原SEA的GPI锚定修饰和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 ,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与SEA嵌合 ,获得了GPI修饰的SEA分子 ,构建的真核表达载体pCI GPI-SEA ,用脂质体方法转染到CHO dhfr-细胞中 ,并用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选 ,细胞免疫荧光分析证实 ,SEA能够在细胞膜上表达。上述GPI锚定修饰的SEA ,可用于进一步研究治疗性肿瘤疫苗。

细胞表面工程与肿瘤疫苗

细胞表面工程 ,又称GPI锚定蛋白转移法 ,是一种不依赖基因转移而能够在细胞膜上表达新蛋白的有效方法。GPI锚定蛋白可以通过其尾部脂质GPI结构自然地整合到细胞膜上。这种方法克服了基因转移技术的一些局限 ,在临床应用上更具优势。该技术可用于肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗方面的研究 ,将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 。

PICC置管术引起静脉血栓的诊断及处理

目的分析肿瘤患者中心静脉(PICC)置管致血栓的原因,总结有效的预防处理措施。方法患者于化疗当日行PICC置管,并给予观察处理。结果158例患者中6例发生静脉血栓,发生率3.8%;经溶栓和抗凝治疗2-10d后,症状逐渐缓解,无1例发生栓子脱落引起重要器官栓塞。结论肿瘤患者PICC致静脉血栓是比较严重的并发症,给予有效的预防处理措施后,可降低静脉血栓的发生;在抗凝和溶栓过程中应密切观察出血倾向及栓子有无脱落导致其他部位栓塞的征象。

恩度联合化疗治疗多种晚期恶性肿瘤的护理

我科于2008年7月～2009年12月采用恩度联合化疗治疗32例晚期恶性肿瘤患者,经过精心护理,取得满意效果。现将护理体会报告如下。

肝癌单克隆抗体HAb18及其F（ab′）_2、Fab片段在小鼠体内的药代动力学研究

作者对１３１Ｉ标记的抗人肝细胞癌单克隆抗体ＨＡｂ１８及Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ片段在小鼠体内的药代动力学进行研究。结果表明：（１）３种标记物的药代动力学模式有很大差异，完整抗体ＨＡｂ１８的清除过程符合开放一空模型，清除速率与注射剂量有关。按照剂量从高至低，其Ｔ１／２（整体排泄）分别为４８．０８ｈ、４２．６５ｈ、４０．５４ｈ；Ｔ１／２（血液清除）依次为６１．４２ｈ、４８．０７ｈ、４１．０３ｈ。（２）抗体片段的清除速率明显快于完整抗体，清除过程呈双相下降，符合二室模型。Ｆ（ａｂ′）。整体排泄的Ｔ１／２ａ为５．２９ｈ，Ｔ１／２β为３９．３７ｈ；血液清除的Ｔ１／２ａ为４．２０ｈ，Ｔ１／２β为３４．６１ｈ。Ｆａｂ片段整体排泄的Ｔ１／２ａ为３．５１ｈ，Ｔ１／２β为２０．２２ｈ；血液清除的Ｔ１／２ａ为１．３９ｈ，Ｔ１／２β为２４．３９ｈ。提示：完整抗体适用于肿瘤导向治疗，显像诊断则以抗体片段为佳。

小鼠GM-CSF的基因克隆和锚定修饰

将糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的细胞因子直接转移到肿瘤细胞膜上,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。克隆了小鼠GM-CSF基因,并通过将从衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列与mGM-CSF嵌合,获得了GPI修饰的mGM-CSF分子,构建并鉴定了GPI锚定修饰的真核表达载体pCI/GPI-mGM-CSF,为进一步研究表面工程治疗性肿瘤疫苗奠定了基础。

中晚期非小细胞肺癌82例的化疗护理体会

目的探讨中晚期非小细胞癌患者化疗期的护理,并采取相应的护理措施,减少并发症及不良反应的发生,减轻患者的痛苦。方法对82例处于化疗阶段的中晚期非小细胞肺癌患者进行临床护理。结果 82例非小细胞肺癌患者在护理人员的综合护理下有效地控制了病情,减少了并发症和不良反应的发生,减轻了负性心理反应,达到了满意的效果。结论对中晚期非小细胞肺癌患者化疗期进行综合护理,可以有效的减少并发症的发生,减轻患者的不良情绪,使患者恢复了自信,提高了自理能力。

广西宫颈癌患者HPV感染情况的分子流行病学调查

目的:调查人乳头瘤状病毒(Human papillomavirus,HPV)各亚型在广西壮族自治区宫颈癌患者中的分布情况,为宫颈癌疫苗的研制提供理论依据。方法:应用凯普HPV核酸扩增分型检测试剂盒对515例广西宫颈癌患者的宫颈组织DNA进行21种HPV亚型的检测;并应用实时荧光定量PCR对HPV16、18和58型阳性样本各50、48和41例的病毒负载量进行了绝对定量检测。结果:1)检测的515例样本中473例HPV阳性,HPV总阳性率为91.84%。HPV16的阳性率最高,为81.40%;其次为HPV18(10.15%);第三位是HPV58(8.67%)。排在前五位的HPV亚型依次为HPV 16、18、58、52及31。2)检测样本中HPV16、18和58型的病毒负载量几何均数分别为2.398 5、0.017 3、0.038 1。HPV16分别与HPV18和58型的病毒负载量比较,有显著性差异(P<0.05);HPV18与58型的病毒负载量比较,无显著性差异(P>0.05)。结论:广西宫颈癌患者中有较高的HPV阳性率,其中HPV16型排在首位,HPV18和58虽然分列第二、三位,但阳性率明显低于HPV16。HPV16的病毒负载量远远高于HPV18和58,说明HPV16的高病毒负载量与其高阳性率可能存在一定关系。

可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达

目的构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况。方法首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Survivin及hCGβ-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆入基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒。接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达。结论成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础。

结核疫苗研究进展

卡介苗(BCG)的免疫保护作用存在争议,多重耐药结核杆菌(MDR-TB)的出现,以及艾滋病(AIDS)的流行,导致结核病(TB)的发病率呈现回升趋势,给TB防治提出了新的挑战。因此,发展新的TB疫苗成为TB防治的迫切需要。本文综述结核疫苗研究的最新进展。

佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎(RA)动物模型;从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞(FLS)。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎;剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似;成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。

抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制

目的 :研制抗人肿瘤坏死因子 (rTNF α)嵌合抗体。方法 :以具有中和TNF α活性的鼠源性单抗 (Z12 )的轻、重链可变区基因 ,构建人 鼠嵌合抗体基因的表达载体 ,并转染COS7细胞。用RT PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF α活性实验 ,分别对瞬时表达的抗rTNF α嵌合抗体 (CZ12 )的细胞培养上清进行检测。结果 :①瞬时转染后 ,细胞系经RT PCR检测有人 鼠嵌合抗体mRNA的转录。②ELISA和Westernblot检测表明 ,CZ12与TNF α产生特异性反应 ,并识别相对分子质量 (Mr)为 170 0 0的TNF α。③竞争抑制实验中 ,CZ12能竞争抑制Z12与rTNF α的特异性结合 ,④体外中和实验证实 ,CZ12能中和TNF α对L92 9细胞的毒性。结论 :成功地研制具有中和活性的人 鼠嵌合抗体CZ12。

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原(mPSCA)基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。

稳定表达hTERT/Luc的小鼠黑色毒瘤肺转移模型的建立

目的建立稳定共表达荧光素酶基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并通过尾静脉注射的方式建立小鼠肿瘤肺转移模型。方法利用DNA重组技术将hTERT基因和荧光素酶基因Luc定向插入到真核表达载体,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000共转染小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418及潮霉素B加压筛选出稳定转染的细胞株。应用Western blot法及免疫荧光法检测hTERT和Luc基因在B16细胞中的表达;将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠建立肿瘤肺转移模型,并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长。结果建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc,经检测hTERT基因和荧光素酶基因Luc在单克隆细胞株中的表达分别为84%和98%。通过尾静脉注射的方式成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型,应用活体成像技术能方便地检测到B16-hTERT/Luc肿瘤在小鼠体内的生长情况。结论成功建立了可用于活体成像技术检测的稳定表达hTERT的小鼠黑色素瘤肺转移模型。

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。