鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是影响鸽产业健康发展的重要病原之一。为实现PiAdV的高通量快速检测,根据GeneBank登录的PiAdV-A种和PiAdV-B种病毒pⅧ基因序列的共同保守区域设计特异性检测引物和探针,经反应条件优化,建立了一种PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:该方法的最佳探针浓度为0.2μmol/L,与鸽群其他常见病毒无交叉反应,对PiAdV的最低检测限为56.9 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍,组内和组间重复变异系数均小于1.8%。利用该方法和常规PCR方法对20份疑似PiAdV感染样品进行检测,发现PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法的病毒阳性检出率高于常规PCR方法。结果表明,本研究建立的PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于PiAdV感染的临床检测及流行病学调查。

我国鸽群主要疫病概述及防治

随着我国养鸽业产业化、规模化发展,鸽群疫病的发生与流行变得错综复杂,而了解我国鸽群主要流行疫病,做好鸽群疫病的预防与控制,对于促进养鸽业高质量发展十分重要。本文概述了鸽新城疫、鸽流感、鸽痘、鸽腺病毒病、鸽轮状病毒病、鸽圆环病毒病、鸽沙门氏菌病、鸽衣原体病、鸽毛滴虫病等我国鸽群主要疫病的流行现状和防控策略,以期为我国养鸽业开展疫病精准防控提供理论依据。

2022年监测中心第四季度禽病检测动态

1鸡病原检测结果2022年10~12月共收到鸡疑似病例样品733份。检测结果显示,检测到的病原以免疫抑制性病原、呼吸道疾病病原和肝损伤性病原为主。在免疫抑制性病原中,以鸡传染性贫血病毒(CAV)居多,CAV疑似病例的阳性检出率是47.5%;其次是鸡传染性法氏囊病毒(IBDV),IBDV疑似病例的阳性检出率是17.5%;鸡呼肠孤病毒(C-REOV)和网状内皮增殖症病毒(REV)两种病原的检出比例相当,其疑似病例的阳性检出率均是2.5%。

鹅源番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定

近几年,鹅“白点病”频发。本研究从江苏沛县地区肝脏有坏死点的发病鹅中收集肝脏病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析进行病毒鉴定,并回归雏鹅进行致病性试验。结果发现:该毒株在鹅胚上生长良好;回归鹅能完全复制出临床中肝脏出现坏死点的病变,并能从实验鹅中重新分离到该病毒;对其主要抗原基因σC进行测序比对和进化树分析发现,其与番鸭呼肠孤病毒基因序列的进化关系较近,同源性为89.6~98.9%。本研究证实了鹅“白点病”的病原为番鸭呼肠孤病毒,为该病的防控奠定了基础。

不同分子生物学方法在H5亚型禽流感病毒检测中的应用比较

H5亚型高致病性禽流感(H5-HPAI)是严重危害家禽养殖业和公共卫生健康的一类动物疫病,也是我国高度重视、严格防控的人兽共患病。目前常用检测H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)的分子生物学技术包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、反转录重组酶辅助扩增(RT-RAA)、RT-RAA结合侧流层析试纸条(RT-RAA-LFD)、RT-RAA-簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白结合侧流层析试纸条(RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD)等。为比较不同检测方法对H5-AIV检测的灵敏度差异,将制备的cRNA标准品进行倍比稀释,分别用RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD进行检测。结果显示:RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD与RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD方法的检测灵敏度分别为10^(2)、10^(-1)、10^(0)、10^(0)、10^(-1)copies/μL。与RT-qPCR相比,RT-PCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD在临床样本检测上具有较高的符合率,分别为85.00%、93.75%、88.75%、91.25%。结果表明,5种方法均对H5-AIV具有良好的检出率,但RT-qPCR与RT-RAA-CRISPRCas13a-LFD灵敏度更高,分别适合在实验室与基层养殖场进行临床检测。本研究评估了不同方法在H5-AIV检测中的应用效果,为在不同场景下选择准确可靠的检测方法提供了参考,也为H5-AIV感染的防控提供了技术支撑。

中草药防治鸡传染性支气管炎

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的急性、高度接触性传染病。该病分布广,血清型多,不同型的病毒株间不能或不能完全交叉保护,这给该病的防治带来巨大困难,因此药物防治非常重要,由于中草药抗病毒有许多优势,因此中草药防治鸡传染性支气管炎成为很好的选择。论文用中医理论分析了鸡传染性支气管炎的致病机理,综述了中草药防治鸡传染性支气管炎作用机理和疗效,分析了近年中草药防治鸡传染性支气管炎存在的问题,对未来运用中草药防治提出合理化建议,旨在为今后研发新型高效的中草药药物提供参考。

鸡传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异的相关性

对国内1992—2005年分离的IBV毒株的纤突蛋白(S1)和核衣壳蛋白(N)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的IBV S1和N基因的序列,对其不同毒株的S1或N基因片段和全长、S1和N基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS11.5进行同源性相关分析。结果表明:不同IBV毒株N或S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关,核苷酸r≥0.892,氨基酸0.854≤r≤0.968;但S1与N基因全长之间核苷酸的遗传变异相关性相对较低一些,而且有些毒株间S1基因同源性很低(r=0.645),但N基因同源性仍很高,显示每个基因变异的独立性。国内IBV疫苗株之间S1和N基因核苷酸高度同源(S1≥97.3%;N≥90.7%),而野毒株与疫苗株相比S1和N基因同源性均较低(S1≤84.3%;N≤87.1%),这也可能与常规疫苗对IBV野毒株不能有效保护有关。

鸡混合感染血清4型禽腺病毒和传染性法氏囊病病毒的诊治

2017年6月,山东某养殖场43日龄蛋鸡群出现发热、精神沉郁、拉黄绿色稀便、黄疸、冠髯苍白、衰弱等症状,剖检表现为:心包腔蓄积大量淡黄色水样液体,肝脏充血、肿大、质脆、色淡,心肌松弛,脾脏、肾脏充血肿大,腺胃乳头有弥散性出血点,肺脏水肿,法氏囊肿大,腿肌点状或条状出血,个别肌肉苍白。根据临床症状、剖检病变、琼脂扩散试验和PCR检测结果确诊为血清4型禽腺病毒和传染性法氏囊病病毒混合感染。

鸡传染性支气管炎病毒S1,M和N基因遗传变异相关性

对山东省1992—2005年分离的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)毒株的纤突蛋白(S1)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的其他具有S1,N和M基因的IBV参考序列,利用DNAStar软件和统计学软件SPSS8.0,对不同毒株的S1,N和M基因分别进行遗传变异和同源性相关分析。结果表明:不同毒株间S1基因与M基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.483,S1基因与N基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.570,M基因与N基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.620,说明S1,M和N基因三者之间的遗传变异既有同步性又有独立性。通过S1,N基因推导的氨基酸系统进化树表明,9株山东野毒株具有较近的亲缘关系,变异方向一致,且与疫苗株的亲缘关系较远,但从M基因推导的氨基酸系统进化树分析,只有3株山东野毒株与部分疫苗株有一定的亲缘关系。由此表明,IBV存在基因重组现象。

肉种鸭产蛋周龄与蛋重对种蛋孵化效果的影响

禽蛋孵化率的高低是由种禽年龄、种蛋品质和孵化条件等决定的。本试验对肉种鸭在相同孵化条件下，就不同产蛋周龄和不同蛋重对孵化率和健雏率的影响进行了研究，旨在探讨产蛋周龄和蛋重对孵化效果的影响，以便在生产实践中发挥积极的指导意义。

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达及其免疫学原性分析

根据对山东IBV流行株的遗传变异分析,选取流行代表株LC2,扩增其S1基因,将其S1基因克隆到pPIC9K载体中,构建了真核表达质粒pPIC9K-S1,经SacⅠ线性化后,通过电转化到毕赤酵母GS115中,经MD/MM及G418筛选,PCR鉴定,获得多拷贝阳性重组菌pPIC9K-S1-GS115。将重组菌在0.5%甲醇中进行诱导分泌表达,对表达产物进行SDS-PAGE,Western blot分析。结果显示,在酵母培养基上清中检测到分子量为90 ku为目的蛋白,与鸡IBV阳性血清发生特异性反应。将表达上清及其重组菌菌体饲喂SPF鸡,40 d后采血,可检测到IBV保护性抗体。结果表明:表达的IBV的S1蛋白具有很好的免疫原性,为ELISA诊断试剂盒的研制及IBV疫苗的研制奠定基础。

“二氧化氯泡腾片”对家禽主要病原微生物杀灭效果试验

为了观察"二氧化氯泡腾片"对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、禽流感H9亚型病毒及鸡新城疫病毒的杀菌及杀病毒效果,采用悬液定量杀菌试验和通过固定病毒稀释消毒液法进行实验室观察。结果:二氧化氯5mg/L作用5min即可对大肠杆菌临床分离株产生100%的杀菌效果。二氧化氯5mg/L作用10min或二氧化氯10mg/L作用5min均能对金黄色葡萄球菌临床分离株产生100%的杀菌效果。2mg/L二氧化氯就能对103EID50新城疫病毒有100%的杀灭作用,而1mg/L不能全部杀灭新城疫病毒。禽流感病毒H9亚型对二氧化氯比新城疫病毒敏感,1mg/L二氧化氯即可对103EID50禽流感病毒H9有较好的杀灭作用。结论:"二氧化氯泡腾片"是一种方便、高效的消毒剂,在较低的浓度条件下,就能对家禽主要病原微生物有杀灭效果。

冬季肉鸡不同饲养模式下环境指标的监测与生产性能分析

为了解山东省内具有代表性的三种肉鸡饲养模式(厚垫料饲养、网上平养和三层阶梯笼养)下环境指标与生产性能的差异,本试验对三种鸡舍分别进行10、25、35 d舍内二氧化碳、氨气、风速、光照、湿度和温度的监测,比较分析各种饲养条件中主要环境指标的差异;同时对比三种饲养模式对生产性能的影响。环境监测结果表明:三种饲养模式的温湿度、二氧化碳、氨气等环境指标有所差异,但从10 d到35 d大都表现为有害气体浓度逐渐增加,温度逐渐降低的规律;相同日龄的三种饲养模式比较结果表明:二氧化碳和氨气等有害气体浓度没有规律可循,氨气是25 d和35 d时,网上平养浓度最高,而笼养的浓度最低;生产性能试验结果表明,料肉比、成活率与出栏体重均是笼养最好。总之,不同饲养模式、不同日龄有害气体浓度以笼养相对较低,同时,笼养模式下生产性能表现最好。

我国SPF鸡的产业化发展战略研究

SPF鸡与鸡胚是供生物学、医学、兽医学等领域从事有关高水平研究,进行多种人、畜、禽用生物制品生产、鉴定所不可缺少的实验原材料。本文分析了当前我国SPF鸡的发展状况及产业化发展中所面临的问题,并对我国SPF鸡未来的健康发展提出了建议。

鸡传染性支气管炎病毒M41、4/91及疫苗株Ma_5、H_(52)、H_(120)N基因的克隆与序列分析

参照IBVN基因序列,设计一对引物通过RT-PCR扩出IBV标准强毒株株M41,传支变异株4/91和疫苗株Ma5、H52、H120的N蛋白基因序列,基因产物大小为1.23kb。序列分析结果表明,M41株与Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为92.2%～92.9%,而经4/91与M41、Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为91.2%～92.0%,结果表明这几个毒株N基因是相对保守的。

免疫不同剂量禽流感疫苗的效果对比试验

1试验目的为了了解不同免疫剂量禽流感疫苗的效果,设计了在不同免疫剂量禽流感疫苗在SPF鸡、普通商品蛋鸡群的免疫实验。2材料方法2.1试验动物21日龄SPF鸡,山东省农业科学院家禽研究所提供;18日龄农大3号,邹平梅子山蛋鸡场。2.2试验疫苗重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-6株＋Re-7株）,青岛易邦生物工程有限公司生产，批号140250301。

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的表达及ELISA诊断试剂盒的研制与应用

为了建立一种鸡传染性支气管炎抗体检测的ELISA方法,本研究根据GenB ank中的传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株LC2的N基因序列,设计一对引物,扩增N基因,将目的基因与载体pE T-32a(+)连接,构建重组表达质粒pE T-32a-N,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pE T-32a-N,纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原建立鸡传染性支气管炎抗体检测的间接ELISA方法,并利用所建立的ELISA方法对临床血清样本进行检测。结果表明,IBV N基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸡传染性支气管炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为2μg·孔^(-1),血清最佳稀释度为1:200,临界值为D450值≥0.297,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与进口IDEXX试剂盒的符合率为96.25%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸡传染性支气管炎母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。综上所述,本研究所建立的N-ELISA方法是一种有效的鸡传染性支气管炎病血清学诊断的方法,并为进一步研究IBV N蛋白的免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗免疫商品肉鸭和SPF鸭的效果研究

为了解重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-8株)的免疫效果,为临床上制定合理的禽流感疫苗免疫程序提供依据,试验选取14日龄樱桃谷商品肉鸭30只和SPF鸭30只,注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)0.4 m L/只作为首次免疫,饲养至28日龄时,樱桃谷肉鸭、SPF鸭随机分成A、B和C、D组,每组均为15只,B、D组再次颈部皮下注射该疫苗0.5 m L/只,均从14日龄起每周采集血清一次,直至56日龄,检测H5抗体情况。结果表明:不同品种鸭对同一亚型禽流感疫苗免疫效果存在差异,首次免疫的日龄可以提至7~10日龄,商品肉鸭一次免疫即可满足防疫需要。

不同日龄SPF雏鸡首次免疫H_5亚型二价灭活禽流感疫苗的对比试验

为了研究鸡在不受母源抗体影响的前提下,不同日龄雏鸡首次免疫接种重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-4株)产生抗体的影响,以便为生产提供依据。本试验选7、14、21日龄SPF鸡各20只进行免疫,免疫3周后进行采血,检测其禽流感抗体,实验数据表明:21日龄免疫接种的免疫效果高于14日龄的,14日龄免疫接种的免疫效果又好于7日龄的。本试验结果可为制定科学的免疫程序提供科学依据。