逆转录病毒介导的人肝癌特异性HSV－tk／ACV的体外抗肝癌作用

目的：建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果：构建携带单纯疮疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法证明ＨＳＶ－ｔｋ基因在ＡＦＰ高分泌的ＨｅｐＧ２细胞中得到特异转录，以阿昔洛韦（ＡＣＶ）为前药攻击转基因的肝癌细胞显示对ＨｅｐＧ２有相对选择性杀伤作用。结论：该ＡＦＰｅ／ＨＳＶ－ｔｋ／前药转换疗法为肝癌特异性基因治疗提供了有价值的资料。

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。

Construction of retroviral vector carrying HSV tk gene under control of human AFP enhancer core sequence and human pgk promotor *

AIM Tenstruct retroviral vector bringing HSV tk gene under control by human AFP enhancer core sequence and human pgk promotor.

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。

HCV、NS5A区部分基因克隆和序列分析

目的 研究输血后肝炎病人的基因型 ,探讨 HCV抵抗 IFN疗效的作用机制。方法 以RT- PCR从慢性丙肝病人血清中扩增一段 4 86 bp的 c DNA片段作目的基因 ,插入 PQE30的多克隆位点 ,构建重组质粒 PQE30 - NS5 A- 1U 1D。结果 应用限制酶酶切和测序分析 ,证实 PQE30 -NS5 A- 1U1D中克隆基因是 HCVJ的 NS5 A部分序列 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 90 %以上 ,包含有干扰素敏感决定区 (ISDR)。结论 血清学抗体检测 NS5 A片段对 HCV诊断有独特的应用价值 。

含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

含ＣＤ基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇小芳，吴宗娣，谢苏庆关键词大肠癌；胞嘧啶脱氨酶基因；逆转录病毒载体；癌胚抗原；转录调控序列胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）是真菌及某些大肠杆菌等ＤＮＡ嘧啶补救合成途径中的关...

含HSV－tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的：为使自杀基因在大肠癌细胞中特异性表达，以达到靶向基因治疗的目的，首先构建以ＣＥＡ基因转录调控序列驱动的重组逆转录病毒载体。方法：将目的基因片段ＨＳＶ－ｔｋ定向克隆入ｐＵＣ１１８质粒载体中，以相应的内切酶取出合适的酶切片段后，与来自ｐＣＥＡ４２４／２ＣＡＴ质粒的ＣＥＡ５＇转录调控序列相连接，克隆入逆转录病毒载体中。结果：经鉴定及筛选，构建成重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ。结论：Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ的成功构建，为进一步研究大肠癌组织特异性基因治疗奠定了基础。

胞嘧啶脱氨酶基因体外特异性前药转换抗大肠癌作用研究

为使胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在大肠癌细胞中特异表达。方法:构建了以CEA基因顺式转录调控序列驱动CD基因的组织特异型重组逆转录病毒载体G1CEACDNa,以脂质体法将重组载体及转录受LTR驱动的CD基因逆转录病毒载体pCD2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞LoVo中,经G418完全选择后进行前药5-FC敏感试验。结果:转导普通型及组织特异型CD基因的LoVo细胞较亲代细胞对5-FC的前药转换抑瘤效应明显(均为P<0.01);而转导组织特异性CD基因的LoVo细胞较转导普通型CD基因的LoVo细胞对5-FC的敏感性显著增高(P<0.01),其IC_(50)分别为0.1mmol/L和0.5mmol/L。结论:表明CEA TRS可驱动自杀基因在高分泌CEA大肠癌细胞中特异性表达,在一定程度上达到了靶向杀伤肿瘤细胞的目的。