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大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用 被引量:1
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作者 王若瑄 罗霞 +5 位作者 李宁求 林强 牛银杰 梁红茹 付小哲 吕爱军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2024年第4期21-27,共7页
【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗... 【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1024000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙虹彩病毒 主衣壳蛋白 多克隆抗体
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大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:1
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作者 孔明慧 梁红茹 +5 位作者 李宁求 林强 牛银杰 罗霞 马宝福 付小哲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期379-384,共6页
为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通... 为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。 展开更多
关键词 大口黑鲈弹状病毒 Taq Man荧光定量PCR N基因
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鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制
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作者 张秋爽 叶彩媚 +5 位作者 牛银杰 林强 梁红茹 罗霞 李宁求 付小哲 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期54-62,共9页
为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在... 为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。 展开更多
关键词 鳜弹状病毒(SCRV) 鳜c-Myc 蛋白互作 谷氨酰胺代谢
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Rho A-Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用
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作者 谭有燕 牛银杰 +4 位作者 李宁求 罗霞 林强 梁红茹 付小哲 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2024年第5期12-20,共9页
【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细... 【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂(CCG-1423和Rhosin)、Rock 1抑制剂(Thiazovivin和Y-27632)及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。 展开更多
关键词 脾肾坏死病毒 病毒复制 Rho A-Rock 1信号通路
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基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法 被引量:10
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作者 付小哲 李宁求 +2 位作者 林强 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1573-1578,共6页
针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测... 针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。 展开更多
关键词 传染性脾肾坏死病毒 疫苗 滴度 定量PCR
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鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:4
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作者 付小哲 李宁求 +2 位作者 林强 刘礼辉 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期363-370,共8页
为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞... 为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性脾肾坏死病毒 主衣壳蛋白 单克隆抗体
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鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析 被引量:3
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作者 付小哲 李宁求 +4 位作者 彭媛媛 林强 石存斌 黄志斌 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期427-433,共7页
从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组09... 从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 传染性脾.肾坏死病毒 ORF093 免疫原性
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鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证 被引量:3
8
作者 付小哲 李宁求 +3 位作者 彭媛媛 石存斌 白俊杰 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期388-393,共6页
将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝... 将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%。研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好。 展开更多
关键词 传染性脾肾坏死病毒 主衣壳蛋白 免疫保护
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约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价 被引量:2
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作者 付小哲 方伟 +5 位作者 林强 刘礼辉 梁红茹 黄志斌 徐德海 李宁求 《南方水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期33-38,共6页
为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和... 为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P<0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P<0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P<0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P<0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P<0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P<0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。 展开更多
关键词 约氏黄杆菌 减毒活疫苗 溶菌酶 免疫球蛋白 相对免疫保护率
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军曹鱼淋巴囊肿病毒主衣壳蛋白基因全序列分析 被引量:2
10
作者 付小哲 石存斌 +3 位作者 李宁求 潘厚军 常藕琴 吴淑勤 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期412-416,共5页
The major capsid protein of lymphocystis disease virus isolated from Rachycentron canadum(LCDV-rc) was amplified and analysed.The 457bp DNA core fragment was amplified with the degenerate primers designed according to... The major capsid protein of lymphocystis disease virus isolated from Rachycentron canadum(LCDV-rc) was amplified and analysed.The 457bp DNA core fragment was amplified with the degenerate primers designed according to the conserved sequences of MCP gene of iridoviruses,then the flaking sequences adjacent to the core region were amplified by inverse PCR,and the complete sequence was obtained by combining all of them.The open reading frame of the gene is 1380bp in length,encoding a putative protein of 459 aa with molecular weight 51.12 kD and pI 6.87.Constructing the phylogenetic tree for comparing the MCP amino acid of iridoviruses,the results indicated that LCDV-rc is most homologous to the other Lymphocystis viruses and all of them constitute a branch.Accordingly LCDV-rc is identified as Lymphocystivirus. 展开更多
关键词 军曹鱼 淋巴囊肿病毒 虹彩病毒 反向PCR 系统进化
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西伯利亚鲟停乳链球菌的分离、鉴定与致病性 被引量:28
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作者 潘厚军 刘晓勇 +6 位作者 常藕琴 王庆 孙慧武 刘瑞明 付小哲 刘雨果 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期891-904,共14页
从患暴发性流行病的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏和心脏中各分离到1株细菌,分离纯化后获得2个分离株,编号分别为AeBF070904、AbHT070912,对分离菌进行了菌株鉴定、致病性分析及药敏实验。分别应用常规生理生化鉴定、全自动细菌测定... 从患暴发性流行病的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏和心脏中各分离到1株细菌,分离纯化后获得2个分离株,编号分别为AeBF070904、AbHT070912,对分离菌进行了菌株鉴定、致病性分析及药敏实验。分别应用常规生理生化鉴定、全自动细菌测定卡API20STREP和ID32STREP进行检测,结果表明,2个分离株均为停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)。对2个分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank中收录的链球菌16S rRNA基因进行序列分析并构建系统进化树,结果显示,2个分离株的16S rRNA基因序列相同,与停乳链球菌同源性最高达97.3%,在系统进化树上与停乳链球菌聚为一簇,进一步确认2个分离株均为停乳链球菌。从人工感染后发病鱼的内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同,确认停乳链球菌是西伯利亚鲟的致病菌。2个分离株对西伯利亚鲟、杂交鲟及剑尾鱼均有致死毒性,37℃培养的细菌毒力比28℃培养的细菌毒力强。2个分离株均对青霉素、诺氟沙星等7种药物敏感;对头孢唑啉、庆大霉素等2种药物耐受;对红霉素中等敏感;对卡那霉素等8种药物菌株之间出现差异。 展开更多
关键词 西伯利亚鲟 停乳链球菌 致病性 细菌鉴定 16S RRNA基因序列 药物敏感
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鲮鱼源无乳链球菌的鉴定、血清型分析及药敏试验 被引量:17
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作者 刘礼辉 张德锋 +4 位作者 李宁求 石存斌 颜曦 付小哲 林强 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2053-2058,共6页
【目的】确诊患病鲮鱼的发病原因,并对其病原菌进行分子血清型及药敏性分析,为有效防治该病提供参考依据,进而促进鲮鱼养殖业健康持续发展。【方法】以常规方法进行患病鲮鱼的病原菌分离纯化,通过形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因... 【目的】确诊患病鲮鱼的发病原因,并对其病原菌进行分子血清型及药敏性分析,为有效防治该病提供参考依据,进而促进鲮鱼养殖业健康持续发展。【方法】以常规方法进行患病鲮鱼的病原菌分离纯化,通过形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析及多位点序列分型(MLST分型)进行鉴定,并采用药敏纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病鲮鱼体内分离获得1株优势菌株(GYCm081),为呈链状排列的革兰氏阳性球菌,其16S rRNA基因片段与无乳链球菌16S rRNA序列(F0393392和NR_102871)的同源性最高,相似性均为100%,系统发育进化树也显示GYCm081菌株与无乳链球菌亲缘关系最近,可确定为无乳链球菌。GYCm081菌株分子血清型为Ib型,MLST型为ST261型,对氨苄西林、氯霉素、壮观霉素、红霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、利福平、环丙沙星、呱拉西林、新生霉素、头孢唑啉、四环素和呋喃妥因等13种药物高度敏感而对磺胺甲噁唑、磺胺甲异噁唑和青霉素G已经产生耐药性。【结论】引起广东阳江某鲮鱼养殖场发病死亡的病原菌为无乳链球菌,其分子血清型为Ib-ST261,实际生产中可选用氨苄西林、恩诺沙星和氧氟沙星等药物进行防治。 展开更多
关键词 鲮鱼 无乳链球菌 分离鉴定 血清型分析 药敏试验
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牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 被引量:21
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作者 林强 李宁求 +3 位作者 付小哲 刘礼辉 石存斌 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期96-102,共7页
以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)... 以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 荧光定量PCR toxR基因
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乌鳢诺卡氏菌病的组织病理学 被引量:20
14
作者 常藕琴 石存斌 +2 位作者 潘厚军 付小哲 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期209-216,共8页
应用病理组织学、活体压片和电镜技术,运用H.E常规染色法和Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色法对患疑似诺卡氏菌病的乌鳢各器官进行观察。结果表明,患病乌鳢的肾脏、肝脏、头肾、脾脏、肌肉、表皮、鳃丝、鳃弓、心脏、肠道、卵巢等器官内... 应用病理组织学、活体压片和电镜技术,运用H.E常规染色法和Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色法对患疑似诺卡氏菌病的乌鳢各器官进行观察。结果表明,患病乌鳢的肾脏、肝脏、头肾、脾脏、肌肉、表皮、鳃丝、鳃弓、心脏、肠道、卵巢等器官内部有大量的慢性肉芽肿结节,直径多为1~2mm。典型结节基本结构可分三层,由内向外依次为:干酪样坏死、类上皮细胞和多核巨细胞、成纤维细胞和纤维细胞包膜,中央干酪样坏死组织中有大量呈长杆状或分枝状的诺卡氏菌。结节活体压片观察到大量的长杆状或分枝状菌体。电镜观察到结节中有大量杆状菌体,未见病毒颗粒;菌体长3.5~6.5μm,宽0.45~6.8μm。器官主要组织病理学变化为:肾小管细胞变性和坏死,肾间质淋巴细胞增生;脾淋巴细胞增生和淤血;肝脂肪变性;鳃上皮肿胀,鳃丝棒状化;心肌细胞肿胀,断裂,溶解;肌纤维水泡变性,肿胀,断裂,溶解,坏死;表皮细胞变性,坏死,脱落,有炎性细胞浸润,诺卡氏菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。对乌鳢诺卡氏菌病的组织病理变化进行了较为系统的研究,可为临床诊断和相关研究提供参考依据。 展开更多
关键词 乌鳢 诺卡氏菌病 组织病理学
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斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定 被引量:20
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作者 刘礼辉 李宁求 +3 位作者 石存斌 潘厚军 付小哲 吴淑勤 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第17期7124-7126,共3页
[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3~0.5)μm×(... [目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3~0.5)μm×(5~10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。 展开更多
关键词 斑点叉尾鲴 烂鳃病 柱状黄杆菌 生理生化鉴定 16S RRNA基因序列分析
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草鱼头肾发生组织学与免疫组织化学观察 被引量:11
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作者 雷雪彬 常藕琴 +3 位作者 石存斌 付小哲 王亚军 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期840-850,共11页
为研究草鱼头肾的组织发生发育,应用组织学技术,对1~103 dph(day post hatching)的草鱼头肾进行观察分析,描述了头肾的组织结构变化及免疫球蛋白M(IgM)阳性细胞及过碘酸雪夫氏(PAS)阳性细胞的发生和分布。结果显示,6 dph,出现头肾原基... 为研究草鱼头肾的组织发生发育,应用组织学技术,对1~103 dph(day post hatching)的草鱼头肾进行观察分析,描述了头肾的组织结构变化及免疫球蛋白M(IgM)阳性细胞及过碘酸雪夫氏(PAS)阳性细胞的发生和分布。结果显示,6 dph,出现头肾原基,原基中原肾管分化形成的肾小管之间出现散在的干细胞。7 dph至16 dph,造血干细胞逐渐分化成不同类型的细胞,免疫细胞数量逐渐增加;17 dph至103 dph,肾小管逐渐退化至完全消失,网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成头肾的主要部分。40 dph肾上腺细胞团开始出现。65 dph与成鱼头肾的组织结构接近,作为淋巴—肾上腺组织存在。PAS阳性细胞最早在7 dph出现;IgM阳性细胞最早出现于17 dph;之后,IgM阳性细胞及PAS阳性细胞逐渐增多,分布于整个头肾组织。研究表明,65 dph草鱼头肾在组织上发育基本成熟;头肾作为草鱼免疫器官的早期发育可以分为3个阶段:无参与免疫反应的细胞、只具有参与非特异性免疫反应的细胞以及参与非特异性免疫反应及特异性免疫反应的细胞组织结构逐步发育完善。 展开更多
关键词 草鱼 头肾 组织发生 免疫组织化学 PAS阳性细胞
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鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化 被引量:8
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作者 李宁求 余露军 +6 位作者 付小哲 刘礼辉 林强 常藕琴 石存斌 黄志斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1754-1762,共9页
菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌... 菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。 展开更多
关键词 鳗鲡 迟缓爱德华氏菌 菌蜕 条件优化
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养殖乌鳢结节病的病原分析 被引量:14
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作者 石存斌 潘厚军 +4 位作者 常藕琴 付小哲 段圣和 梁裕昕 吴淑勤 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第16期7384-7386,7397,共4页
[目的]分析了解乌鳢结节病的病原。[方法]以患病乌鳢为研究材料,通过组织病理学观察和人工感染试验,确定乌鳢结节病的病原性质;通过基本生理生化特性、16 S rRNA基因部分序列和药物敏感性的测定,对乌鳢结节病的病原进行鉴定。[结果]组... [目的]分析了解乌鳢结节病的病原。[方法]以患病乌鳢为研究材料,通过组织病理学观察和人工感染试验,确定乌鳢结节病的病原性质;通过基本生理生化特性、16 S rRNA基因部分序列和药物敏感性的测定,对乌鳢结节病的病原进行鉴定。[结果]组织病理学观察显示典型结节的中央为干酪样坏死,内含坏死的组织细胞和白细胞,其间有大量呈长杆状或分枝状菌丝;从病鱼的肾脏、肝脏等多个组织及腹水中均分离培养出细菌,用分离菌株作回归感染,证实分离菌株为乌鳢结节病的病原菌;通过对病原菌的基本生理生化特性测定和16 S rRNA基因部分序列分析,初步确定乌鳢结节病的病原为诺卡氏菌属的鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。[结论]该研究为乌鳢结节病的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乌鳢 结节病 病原 鱼师诺卡病菌
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日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的分离与鉴定 被引量:7
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作者 余露军 李宁求 +4 位作者 刘礼辉 付小哲 石存斌 潘厚军 吴淑勤 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期799-803,共5页
目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和... 目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和HSP60基因序列,构建了系统进化树。结果按形态特征和API-ID32E鉴定系统分别初步鉴定菌株AnGH080301和AnGH080302为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌。菌株AnGH080301的16SrRNA基因部分序列(登录号FJ646618)与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因(登录号AB050832)同源性最高,达99.7%;菌株AnGH080302的HSP60基因部分序列(登录号FJ646619)与创伤弧菌HSP60基因(登录号BA000037)的同源性最高,达99.8%。结论综合菌株的生理生化特性和分子生物学鉴定结果,可将菌株AnGH080301和AnGH080302分别鉴定为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌,迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌均为人兽共患病病原,其混合感染日本鳗鲡致病的报道尚属首次。 展开更多
关键词 日本鳗鲡 迟缓爱德华氏菌 创伤弧菌 混合感染
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同步接毒条件下鳜传染性脾肾坏死病毒在CPB细胞中的最适增殖条件 被引量:5
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作者 罗霞 付小哲 +3 位作者 李宁求 林强 张悠 黄志斌 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1712-1720,共9页
为了获知鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)同步接毒最适增殖条件,通过检测不同血清浓度、病毒接种量、细胞状态等培养条件下的病毒拷贝数,确定鳜脑组织细胞(CPB)同步接种ISKNV的最适体外增殖条件。结果表明,上述各因素对ISKNV的增殖量均有... 为了获知鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)同步接毒最适增殖条件,通过检测不同血清浓度、病毒接种量、细胞状态等培养条件下的病毒拷贝数,确定鳜脑组织细胞(CPB)同步接种ISKNV的最适体外增殖条件。结果表明,上述各因素对ISKNV的增殖量均有明显影响。其中选取处于对数生长中期的CPB细胞,胰酶消化后按照病毒感染复数(MOI)为0.2同步接种ISKNV,培养液中胎牛血清终浓度为6%时,28℃恒温培养9 d后收获,所得病毒拷贝数最多,为2.54×108拷贝/m L。将所测得病毒拷贝数折算成培养基成本进一步分析表明,按照上述相同条件进行接毒,每元人民币培养基所得病毒量也最高,为4.24×1011拷贝。综上所述,本研究基于病毒增殖量及培养基成本对病毒增殖条件进行优化,可为低成本ISKNV疫苗的生产提供理论依据。 展开更多
关键词 传染性脾肾坏死病毒 鳜脑细胞 同步接毒 荧光定量PCR 增殖条件
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