“统计学方法选择及SPSS实现”思政内涵挖掘

“生物统计学”是生物学研究生重要的“工具性”专业课程,对其科研和综合素质的培养及完成科研课题具有重要的作用。通过“统计学方法选择及SPSS实现”课程教学实践,探索建立适合于生物学专业研究生“生物统计学”课程思政教育模式,并进一步挖掘课程思政教育内涵。对北京交通大学的2020级、2021级和2022级生物专业参与“统计学方法选择及SPSS实现”任选课程的43名研究生进行授课前后的问卷调查及分析。结果表明,超过95%的研究生迫切希望掌握生物统计学知识,通过“生物统计学”课程学习,研究生对生物统计学的基本概念、统计学方法选择及SPSS软件使用等掌握程度显著提高。在课程中融入思政教学案例,挖掘生物统计学思政教育内涵,使学生接受全方位、立体化的生物统计学思政教育,培养学生严谨务实的态度、实事求是的工作作风和理性实证的探索精神。

人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。

人呼吸道合胞病毒疫苗研发的突破及挑战

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)已被发现60余年。在经历了20世纪60年代RSV疫苗研发失败后,基于融合前融合糖蛋白(prefusion fusion glycoprotein,preF)的RSV结构性疫苗目前已取得突破性进展,通过接种孕妇和60岁以上老年人群,为新生儿及老年人群提供有效保护,从而解决了预防RSV感染“无苗可用”的历史难题。2023年是RSV疫苗研发的里程碑,也将成为新的起点。在此背景下,本文系统介绍了RSV疫苗研发进展、面临的挑战及今后的发展方向,提出针对RSV不同易感人群应采用不同疫苗形式的科学依据及对策,并对RSV感染重点人群(如血清学阴性婴幼儿等低龄儿童)的疫苗研发难点及候选疫苗形式进行了全面分析。结合基于RNA病毒反向遗传学技术的RSV减毒活疫苗(live-attenuated vaccine,LAV)研发设计、临床试验数据及黏膜疫苗优势,笔者认为RSV LAV是预防6个月及以上婴幼儿和低龄儿童RSV感染的前景较好的候选疫苗,有望为RSV疫苗研发带来新突破。此外,本文就如何加强我国RSV疫苗研发提出建议。

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。

不同剂量HgCl_2与CdCl_2联合对去卵巢大鼠的雌激素样作用

目的:探讨不同剂量HgCl2与CdCl2联合对去卵巢大鼠的雌激素样作用。方法:66只雌性去卵巢SD大鼠随机分为11组,每组6只,分别给予低、中、高剂量的HgCl2(0.04mg/kg、0.20mg/kg和1.00mg/kg)和CdCl2(0.08mg/kg、0.40mg/kg和2.00mg/kg)及低剂量HgCl2联合低、中、高剂量的CdCl2,阴性对照组给予蒸馏水,阳性对照组给予雌二醇,连续3d,检测各组大鼠的子宫脏器系数和嗜银染色颗粒数。结果:与阴性对照组比较,高剂量HgCl2组、高剂量CdCl2组及低剂量HgCl2与低、高剂量CdCl2联合组大鼠的子宫脏器系数升高,Ag-NORs颗粒数增加(P<0.05);与对应剂量CdCl2组比较,低剂量HgCl2与低剂量CdCl2联合组的子宫脏器系数升高,Ag-NORs颗粒数增加(P<0.05)。结论:低剂量HgCl2与CdCl2联合可能具有雌激素样作用。

HgCl2、CdCl2对去卵巢大鼠的雌激素样作用

目的:评价HgCl2、CdCl2的雌激素样作用。方法:将成年雌性SD大鼠48只随机分为8组,去卵巢后,给予低、中、高剂量的HgCl2(0.04mg/kg、0.20mg/kg和1.00mg/kg)和CdCl2(0.08mg/kg、0.40mg/kg和2.00mg/kg),阴性对照给予蒸馏水,阳性对照给予雌二醇,连续3d,观察子宫增重作用、子宫内膜细胞有丝分裂指数和嗜银染色颗粒数。结果:HgCl2和CdCl2高剂量组可诱导去卵巢SD大鼠子宫明显增重,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P均<0.05)。HgCl2低、中、高剂量组和CdCl2中、高剂量组有丝分裂指数均高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均<0.05)。HgCl2和CdCl2高剂量组嗜银染色颗粒数高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论:HgCl2、CdCl2在体内可能有雌激素样作用。

HgCl_2对大鼠子宫雌激素受体的影响

目的:探讨HgCl2对子宫雌激素受体的影响及其雌激素样作用机制。方法:30只大鼠行双侧去卵巢手术后随机分为阴性对照组(蒸馏水)、低、中、高剂量HgCl2组(0.04mg/kg、0.20mg/kg、1.00mg/kg)和阳性对照组(0.08mg/kg雌二醇),连续用药3d后取子宫,采用放射性配基结合分析法和雌激素受体结合试验检测雌激素受体数量。结果:HgCl2各浓度组放射活性与阴性对照组比较,差异无统计学意义(F=2.32,P=0.1030)。HgCl2各浓度组雌激素受体数量与阴性对照组比较,差异无统计学意义(F=0.663,P=0.624),也无相关性(rs=0.236,P=0.345)。结论:HgCl2不影响雌二醇与雌激素受体结合,也不影响雌激素受体的数量,可能通过其他途径显示雌激素样作用。

靶向树突状细胞的呼吸道合胞病毒F重组蛋白的构建与体外活性分析

分析以人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein,F)为抗原靶向DEC205/CD205受体策略对重组F蛋白表达及活性的影响.F蛋白是RSV的重要中和抗原,克隆RSV F蛋白胞外区的编码基因至可识别鼠树突状细胞(Dendritic cells,DCs)DEC205受体的单链抗体(single chain antibody of anti-DEC205,scDEC)的C端,构建可表达重组F蛋白(scDECF)的质粒pVAX1/scDECF,Western blot方法检测scDECF的表达,免疫荧光法和流式细胞术检测表达的scDECF与DEC205受体的结合活性.经Western blot证实在pVAX1/scDECF转染的293T细胞成功表达了scDECF.将所获得的细胞培养上清与表达鼠DEC205受体的细胞CHOmDEC205孵育,用免疫荧光和流式细胞术证实:与作为对照的重组F蛋白scISOF相比,所获得的scDECF与CHOmDEC205细胞呈现明显的结合.本研究成功表达了重组蛋白scDECF,且所获得的重组蛋白scDECF具有与表达DEC205受体的细胞特异性结合的活性.

低剂量汞对镉诱导大鼠子宫增重作用的影响

目的 了解HgCl2 对CdCl2 雌激素样作用的影响。方法 以HgCl2 、CdCl2 等为受试物 ,设不同剂量的组合检测其对去卵巢SD大鼠子宫的诱导增重作用 ,并以E2 为阳性对照。结果 1.0 0mg/kgHgCl2 和 2 .0 0mg/kgCdCl2 均可诱导去卵巢SD大鼠子宫明显增重 ,与阴性对照组相比差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。 0 .0 4mg/kgHgCl2 与不同剂量的CdCl2 联合染毒 ,可致去卵巢SD雌性大鼠子宫明显增重 ,与阴性对照组相比 ,不仅高剂量组差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,低剂量也有统计学意义 (P<0 .0 5 )。结论 低剂量HgCl2 对CdCl2 具有雌激素样的联合作用。

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P、L和M2-1重组质粒的构建和鉴定

目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT。设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P。同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L。用重组质粒转染BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达。结果成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达。结论获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础。

免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒F蛋白方法的建立

目的利用免疫磁珠分离技术(IMS)建立快速纯化人呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F)的方法。方法表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞,收获细胞裂解液,利用兔抗人RSV多抗包被表面活化的免疫磁珠富集和纯化F蛋白,同时建立夹心ELISA,检测纯化的F蛋白浓度以及F蛋白的回收率。结果采用IMS成功纯化分子量为145～170 ku区间的二聚体RSV F蛋白,SDS-PAGE分析结果显示F蛋白得到很好的纯化,纯化所得RSV F蛋白浓度为116 mg/L,回收率为41.1%。结论利用IMS可有效地富集和纯化RSV F蛋白。

携带Aβ37-42肽段的重组乙肝病毒表面抗原病毒样颗粒的制备

目的采用杆状病毒表达系统制备携带Aβ37-42肽段的重组乙肝病毒表面抗原(HBsAg)病毒样颗粒(VLPs)。方法将Aβ42分子的C末端6个氨基酸进行3个串联后,插入到HBsAg的113 aa与114 aa之间,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建表达HBsAg Aβ37-42的重组杆状病毒载体,转染Sf9细胞,Western blot鉴定目的蛋白表达情况,用氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心纯化,电镜观察VLPs的形态。结果制备并纯化出HBsAg VLPs和携带Aβ37-42肽段的HBsAg VLPs(HBsAgAβ37-42 VLPs)。结论制备携带Aβ抗原表位的重组HBsAg作为一种阿尔茨海默病(AD)疫苗具有一定的可行性,值得进一步探讨。

氯化汞对大鼠子宫内膜细胞的增殖作用

目的研究氯化汞对去卵巢大鼠子宫内膜细胞的增殖作用。方法将成年雌性大鼠去卵巢后,给予不同剂量的HgCl2(0.04mg/kg、0.20mg/kg和1.00mg/kg)连续3d,观察子宫内膜细胞有丝分裂指数和嗜银染色颗粒数。结果氯化汞低、中、高3个剂量组有丝分裂指数,均高于阴性对照组,差异有显著性(P<0.05),且有明显的剂量-效应关系。同时氯化汞高剂量组嗜银染色颗粒数,与阴性对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。结论氯化汞能加速细胞的分裂和增殖,因此,推断它在大鼠体内可能具有雌激素样作用。

氯化镉对大鼠子宫内膜细胞的增殖作用

目的研究氯化镉对去卵巢大鼠子宫内膜细胞的增殖作用。方法将成年雌性大鼠去卵巢后，给予不同剂量的CdClz（0．08mg,／kg、0．40mg／kg和2．00mg／kg）连续3d，观察子宫内膜细胞有丝分裂指数和嗜银染色颗粒数。结果氯化镉中、高荆量组有丝分裂指数分别为0．81％，0．97％，均高于阴性对照组，差异有显著性（P〈0．05）。同时氯化镉高剂量组嗜银染色颗粒数为1．36～1．53，与阴性对照组相比，差异有显著性（P〈0．05）。结论氯化镉能加速细胞的分裂和增殖，因此，推断它在大鼠体内可能具有雌激素样作用。

COX-2、NF-κB在胃癌组织中的表达及临床意义

目的研究COX_2与NF_κB在胃癌组织中的表达,探讨两者与胃癌发生、发展之间的关系及意义。方法采用免疫组化法对53例胃癌组织和15例相对正常胃黏膜组织标本进行检测,观察COX_2与NF_κB的表达情况。结果COX_2及NF_κB在胃癌组织中均呈高表达状态(62·26%,83·02%),其阳性表达率明显高于正常胃黏膜组织(6·67%,13·33%),差异有显著性(P<0·05)。同时,COX_2和NF_κB在胃癌中的高表达与浸润深度和有无淋巴结转移有关(P<0·05),且两者之间存在显著正相关性(r=0·437,P<0·01)。结论COX_2及NF_κB参与了肿瘤的形成,且与胃癌的侵袭、转移及预后也有一定关系。

人呼吸道合胞病毒感染不同细胞基因的差异表达分析

目的 采用生物信息学方法,筛选人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)感染人喉表皮样癌细胞(human larynx epidermoid carcinoma cells,HEp-2)与人肺(支气管)上皮细胞(human normal lung epithelial cell,BEAS-2B)后均具有表达差异的基因,为了解宿主与RSV之间的相互作用提供线索。方法 从基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中下载RSV感染HEp-2与BEAS-2B细胞的转录组数据,运用R软件进行转录组数据差异表达分析,筛选差异表达基因。利用DAVID数据库对差异表达基因进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,采用STRING数据库网站构建蛋白共作网络(Protein-Protein Interaction Network Analysis,PPI),并运用Cytoscape软件中的CytoHubba插件寻找差异表达基因中的关键基因。最后,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)对RSV感染HEp-2与BEAS-2B细胞后均差异表达的基因进行验证。结果 筛选出135个RSV感染HEp-2与BEAS-2B细胞后均差异表达的基因,其中有132个上调基因,3个下调基因。这些基因主要富集在炎症反应和肿瘤坏死因子信号通路。CytoHubba评分确定2个关键基因CTGF和IL-11,qRT-PCR结果显示,2种细胞被RSV感染后,CTGF与IL-11基因表达水平均显著增强。结论 本研究通过对基因转录组数据的分析以及实验验证,发现CTGF和IL-11基因在RSV感染的HEp-2与BEAS-2B细胞中均表达显著增强,与转录组数据差异表达分析结果一致,提示2个基因参与了RSV感染过程,CTGF和IL-11是影响RSV复制的宿主基因,该发现有助于找到防治RSV的新靶点,为RSV防治策略提供新思路。

反向遗传学在呼吸道合胞病毒减毒活疫苗研究中的应用

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原,减毒RSV活疫苗能模拟自然感染充分活化机体固有免疫系统,并诱导产生体液免疫和细胞免疫,不会产生疾病增强作用,经黏膜途径应用,能突破母传抗体的干扰,因而受到广泛关注,反向遗传学(reverse genetics)在减轻野生型RSV毒力和增强其免疫原性等方面具有传统减毒技术不可比拟的优势,所以综述了反向遗传学在RSV减毒活疫苗研究中的应用。

辅助病毒依赖型腺病毒载体研究进展

辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd)缺乏所有腺病毒的编码序列,与非复制型的第一代腺病毒载体(first-generation adenoviral vector,FGAd)相比,具有载体免疫原性低、安全、转移容量大和持续表达等特点,现广泛用于遗传性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等的基因治疗和特异性靶向治疗研究。本文综述了HDAd构建和应用等方面的研究进展及未来的发展方向。

呼吸道合胞病毒载体疫苗研究进展

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原,RSV载体疫苗可在人细胞内从头合成,形成的蛋白质构象与RSV自然感染后表达的完全相同,不会导致抗原表位的丧失或变化,形成的免疫力更利于抵抗随后的自然感染;经黏膜途径免疫不会产生疾病增强作用,且能突破母传抗体的干扰,因而受到广泛关注。对近年来RSV载体疫苗的研究进展进行了综述。

呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化

目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列，获得COOH’端带有His标签的重组SF-His蛋白编码基因，利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒，用脂质体Cellfeetine reagent转染sf9细胞，实现sF在sf9细胞中的表达，Ni柱亲和层析纯化sF蛋白。结果成功获得了sF-His编码基因，构建的重组杆状病毒可高效表达sF，Ni-柱纯化后sF的浓度为1．084mg／ml，纯度达90％以上。结论杆状病毒系统是制备sF的有效方法，纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础。