猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

微生物油脂提取技术的研究进展

该文介绍了微生物油脂的组成特点、国内外研究现状、生产工艺,着重叙述主要提取方法,包括超临界CO2萃取法、有机溶剂萃取法、索氏抽提法、酸热法、酶解辅助萃取、超声波辅助萃取、反复冻融辅助萃取和微波辅助萃取,分析论述了这些方法对产油微生物油脂萃取率的影响,同时总结了这些提取方法的原理、优点和研究现状,并分析了微生物油脂提取技术的发展趋势。

响应面法优化油脂酵母发酵产油的影响因子

微生物油脂作为一种新型油料资源,研究其发酵条件具有重要意义.以实验室保存菌株EAM-AC16为出发菌,通过单因素试验和响应面法优化菌株EAM-AC16的发酵条件.确定最优发酵条件为:葡萄糖浓度82.37 g/L,接种量9.45%,培养时间为146.4 h,pH6.0,培养温度30℃,空气量(装液量mL/三角瓶mL)70mL/250mL和(NH4)2SO4浓度1 g/L时,菌株EAM-AC16的油脂产量达5.204 g/L.利用气相色谱分析菌株EAM-AC16合成油脂的主要成分为:棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3)等.

粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆与表达分析

以粘性丝孢酵母BG基因为研究对象,采用PCR方法克隆出BG基因的部分CDs区片段,并用RT-PCR方法分析了BG在不同培养条件下的表达量.实验结果如下:克隆扩增获得长为570 bp,编码189个氨基酸的部分CDs区片段.通过实时荧光定量PCR方法分析粘性丝孢酵母BG基因在不同pH、C/N、温度以及培养时间下的表达量.结果显示培养温度、pH、C/N对粘性丝孢酵母BG基因表达量无显著性影响.培养时间对其具有显著性影响,呈先上升后下降的趋势,在第3 d时表达量最高且极显著高于其他培养时期.此研究为进一步研究该基因的功能奠定了基础.

马铃薯淀粉水解条件优化及油脂酵母培养研究

以马铃薯淀粉为底物,葡萄糖含量为评价指标,通过响应面法优化淀粉酶解工艺,将水解液用于发酵生产微生物油脂。最佳酶解条件为马铃薯淀粉质量浓度20 mg/m L,加酶量为干淀粉质量3.2%,α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的质量比2.2∶1,p H 4.1,酶解时间4.1 h,得到最高葡萄糖含量为15.06 mg/m L。向此水解液中添加一定氮源和无机盐用于油脂酵母菌株Y004-2培养,在250 m L三角瓶中其生物量为14.43 g/L,油脂产量5.16 g/L,在5.0 L发酵罐中生物量为14.27 g/L,油脂产量5.10 g/L,其生物量和油脂产量均略高于以葡萄糖为碳源;且菌株Y004-2在以马铃薯淀粉水解液为碳源的培养基中所得油脂的组成与以葡萄糖为碳源的培养基中所得油脂的脂肪酸组成相同。

非洲猪瘟病毒的分子病原学及致病机理研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种烈性传染病,具有急性、高热、高病死率等特征,主要暴发于非洲、东欧国家、俄罗斯及高加索地区。目前,该病缺乏有效的疫苗和治疗方法,给病情爆发地区的养猪业造成严重的影响。ASFV的主要靶细胞是网状内皮细胞和单核—巨噬细胞,造成细胞凋亡,影响宿主的免疫系统,进而表现出相应的疫病特征。ASFV具有基因组较大、基因型较多且易变异等特征。文章主要从分子病原学和致病机理方面对ASFV的研究情况进行综述,为ASF的防控提供理论依据。

非洲猪瘟病毒结构蛋白在病毒感染过程中的作用

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、出血性的猪传染性疫病,给疫情发生国家(地区)的养猪业带来严重的经济损失。ASFV 作为双股DNA 病毒,含有150-167 个开放阅读框(ORFs),编码200 余种蛋白质,其中结构蛋白约50 种。结构蛋白作为病毒颗粒的主要组分,在病毒吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。综述了ASFV 结构蛋白在病毒感染中的作用,以期为ASFV 结构蛋白的进一步研究提供参考。

非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。

南非2型口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)感染会引起偶蹄动物发生口蹄疫(FMD),产生急性系统性传染性水疱。其分为7个血清型,包括A、O、C型,亚州1型(Asia 1)及南非1、2、3型(SAT1、2、3)。其中,SAT FMDV具有明显的地域性,主要集中在撒哈拉沙漠以南,侵害水牛及野生动物,容易发生抗原变异,疫苗交叉保护效果低。近几年的报告表明,中东地区暴发了SAT2FMDV,跨越了长久以来的地域界限,也对我国的养殖业造成了潜在的威胁。我国在SAT FMDV方面的研究较少,有必要建立特异性和灵敏性高的SAT FMDV监测方法作为战略储备,以防其跨境传播。论文主要介绍了SAT2FMDV结构蛋白抗原表位国内外研究进展,以期为今后研发有关SAT2FMDV战略储备表位疫苗提供理论依据。

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。

猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的多克隆抗体。以PCV2毒株(CAU0673)DNA为模板进行PCR,扩增目的片段大小约为702bp,构建pET30a-PCV2-Cap重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对目的蛋白进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化、复性,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;将纯化后的重组Cap蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,经背部皮下多点注射4次,免疫新西兰大耳白兔,制备成兔抗Cap蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)验证兔抗血清特异性,并用间接ELISA测定抗血清抗体效价。PCR、双酶切和测序鉴定结果表明,重组质粒pET30a-PCV2-Cap构建正确;重组Cap蛋白以包涵体的形式表达,大小约为34kD,复性后重组Cap蛋白可与PCV2阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体与PCV2重组Cap蛋白和全病毒抗原均可发生反应,ELISA抗体效价>1∶12800,显著高于商品化疫苗组。

SAT2型口蹄疫分子病原学与分子流行病学研究进展

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种人畜共患的高度接触性传染病。现已确定有7种病毒血清型,即O、A、C型,SAT1,SAT2,SAT3和Asia1型,SAT2至少由14个遗传拓扑型和3个血清亚型组成,SAT2主要流行于撒哈拉沙漠以南的非洲地区,主要感染野生动物尤其是非洲水牛,给发病地区的畜牧业带来了巨大的经济损失。主要从分子病原学和分子流行病学对SAT2口蹄疫研究情况进行综述,为SAT2型口蹄疫的防控提供了理论依据。

猪细小病毒6型ORF 2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF 2基因,并制备PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF 2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白大小约为40 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该蛋白可与PPV6阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性;Western blotting间接与ELISA结果显示,纯化后免疫兔血清与PPV6全病毒蛋白发生特异性反应,抗体效价为1∶25600;IFA鉴定结果表明,PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白兔源多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究成功原核截短表达了PPV6 ORF 2基因并制备了兔抗PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为PPV6血清学检测方法的建立和PPV6 VP1蛋白的进一步研究提供了参考。

LAMP的发展及在口蹄疫诊断中的应用

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification Method,LAMP)是一门新兴的基因扩增技术,具有操作简单、快速、高特异性、高敏感性、不需要特殊检测设备等特点。随着分子生物学技术的发展,LAMP也得到了长足的发展:多重引物的设计和与ELISA的联合使用使得能够同时检测多种病原以及与实时荧光技术的配合可以实现实时监测反应的过程。LAMP检测技术也已广泛用于临床疾病的诊断、病原微生物,包括流行性细菌或病毒等的定性检测及动物物种和胚胎的性别鉴定,此外它也应用于口蹄疫这种人畜共患的急性传染病的检测中。从简单的LAMP到多重LAMP,再到多重荧光检测以及与其他技术的连用,使得口蹄疫的检测方法不断进步。简述了LAMP的相关原理、发展和应用以及在口蹄疫病毒检测中的应用等研究进展。

非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达

探索非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)调控细胞因子产生和细胞死亡的机制。利用NLRP3炎症小体表达系统,筛选发现ASFV-C84L蛋白诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌上调。首先,利用生物信息学分析C84L的结构信息,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)确定C84L蛋白在ASFV感染后的表达时序,细胞内定位;同时,用荧光素酶活性检测和蛋白免疫印迹(Western-blot)确定C84L蛋白参与调控p65的磷酸化以及IL-1β的成熟和细胞焦亡;然后,用碘化丙啶(PI)染色观察C84L蛋白诱导细胞的死亡情况;最后,使用qPCR和酶联免疫吸附试验检测C84L蛋白对IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录和分泌的影响。结果显示:C84L为亲水性蛋白,与沙门菌效应蛋白Sif A具有同源性;ASFV感染原代猪肺泡巨噬细胞4 h后,C84L m RNA表达水平逐渐上调,后续持续表达,第8小时达到顶峰;而且IFA结果显示,C84L蛋白在细胞质和细胞核中均有定位。荧光素酶和Western-blot结果显示,C84L促进p65的磷酸化并激活NF-κB启动子的活化。PI染色结果显示,C84L真核质粒转染细胞后诱导细胞死亡,Western-blot结果也显示C84L诱导Caspase-1成熟以及膜孔蛋白N-GSDMD (GSDMD剪切后的N端片段)剪切。将C84L真核质粒转染细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子转录水平呈剂量依赖性升高;与转录水平相似,C84L表达诱导IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平上调。结论:ASFV C84L蛋白通过激活NF-κB以及NLRP3炎症小体诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达水平上调以及细胞焦亡的发生。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的核衣壳蛋白N是一种含量高、免疫原性强、最早刺激机体产生特异性抗体的主要结构蛋白，研制针对N蛋白抗体的检测方法对进一步实现PRRS的流行病学监测和诊断具有重要意义。本研究以带有MBP标签的pMAL—C4X作为表达载体。实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，每升菌液经纯化可得约20mg的融合N蛋白。Western—blot结果表明．融合N蛋白能被抗MBP的单抗和PRRSVN蛋白的家兔多抗特异识别。以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法不与猪圆环病毒2型（PCV2）、古典猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的阳性猪血清发生交叉反应，但与1型PRRSV阳性猪血清有较强反应性。田间样品检测结果表明。本研究建立的间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。本研究以MBP作为促溶标签，实现了PRRSVN蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，重组蛋白具有良好的免疫反应性．这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。

PRRSV标记病毒样颗粒的制备及其鉴定

当今预防猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的灭活苗和弱毒苗都存在不可避免的局限性,所以研制新型疫苗势在必行。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）在形态结构上与天然病毒粒子无异,生物安全指数高,是理想的传统疫苗替代品。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）粒子主要由能够诱导产生中和抗体的GP5蛋白和具有强细胞免疫力的M蛋白组成基本框架结构。本研究以2型高致病性PRRSV的GP5蛋白和M蛋白为研究对象,通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建标记型PRRSV VLPs,同时探索核衣壳蛋白N对VLPs形成的影响。在本试验中将含有Myc标签的GP5（Myc-GP5）和含有His标签的M（His-M）蛋白基因分别克隆至pFastBac dual载体的p10和pH双元启动子下;N蛋白基因克隆至pFastBac HTB载体上,转染sf9和Highfive细胞后,GP5、M和N蛋白均被成功表达。透射电镜观察结果表明,Myc-GP5和His-M能够自动组装成VLPs,并且与天然PRRSV形态一致,具有双层膜结构,直径大小在40-60 nm。采用抗M蛋白的家兔血清进行免疫电镜观察,结果显示,Myc和His双标记型VLPs与天然病毒一样都能够被金颗粒标记,而且共感染的N蛋白不影响标记型VLPs的组装。本研究首次采用昆虫杆状病毒表达系统成功制备了PRRSV的双标记型VLPs,具备与天然病毒相似的特性,为开发高效安全以及能够区分感染与免疫VLPs疫苗奠定了基础。

猪圆环病毒2b亚型Cap融合蛋白的原核表达及其免疫原性分析

目的原核表达猪圆环病毒2b亚型(porcine circovirus subtype 2b,PCV2b)Cap融合蛋白,并分析其免疫原性。方法以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列,His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的片段;将其产物克隆至pMAL-C4x载体中,构建pC4x-PCV2b-Cap重组质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行直链淀粉树脂纯化。SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性,Western blot检测其反应原性;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pC4x-PCV2b-Cap构建正确;融合蛋白MBP-Cap(matlose binding protein Cap)最适诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,其以可溶性形式存在,相对分子质量约为81000,与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBPtag多克隆抗体及免疫小鼠抗血清均可发生特异性反应。结论成功构建了pC4x-PCV2b-Cap重组表达载体,获得了可溶性的MBP-Cap蛋白,其纯化蛋白具有较好的免疫原性。本文为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。

猪细小病毒AV30 VP2基因在昆虫细胞中表达及其免疫原性鉴定

本研究选用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建含有猪细小病毒AV30未优化、优化后衣壳蛋白VP2基因的重组杆状病毒,感染sf9、HF细胞表达VP2蛋白。首先,扩增PPV AV30得到VP2基因,测序后由公司根据昆虫细胞嗜性进行基因优化。同时构建并收获未优化、优化重组杆状病毒r BacVP2。其感染HF细胞后,进行Western-blot及IFA实验分析表明,未优化、优化VP2蛋白在昆虫细胞中正确表达,分子质量约为64 ku,并具有良好的反应原性。电镜观察,未优化、优化VP2蛋白均自我组装成VLP,与PPV AV30病毒粒子大小形状相似。最后,用VP2-VLP免疫BALB/c小鼠,能刺激小鼠产生抗PPV的特异性抗体。免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞在PPV AV30病毒的刺激后,出现显著的增殖情况,同时产生了Th1和Th2型相关细胞因子。本研究成功构建了VP2-VLP,并在小鼠实验中显示了良好的免疫效果,为以VP2为表位载体的嵌合型病毒样颗粒疫苗进一步研制奠定了基础。

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体。方法以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6 h。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价。结果经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95%以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价>1∶25 600,显著高于商品化疫苗组。结论成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础。