黄萎病菌诱导下陆地棉酵母双杂交文库的构建及GhMAPKKK2互作蛋白的筛选

为了探究棉花响应黄萎病菌侵染的分子机制并筛选GhMAPKKK2的互作蛋白,以陆地棉XLZ35为材料,基于Gateway克隆技术构建了棉花黄萎病菌诱导的陆地棉酵母双杂交文库,其中初级文库和次级文库的库容分别为1.2×10^(7)和2.0×10^(7)CFU,插入片段重组率均为100%且平均长度大于1000 bp。次级文库质粒浓度为953 ng·μL^(-1),符合构建酵母文库的标准,可用于酵母双杂交筛选互作蛋白。构建了pGBKT7-GhMAPKKK2表达载体,并验证了该载体对酵母细胞无毒性且不存在自激活活性。以GhMAPKKK2为诱饵蛋白,利用酵母文库初步筛选,获得81个阳性互作蛋白,经测序对比选取6个候选蛋白,通过酵母双杂交及双分子荧光互补试验(BiFC)验证,明确了候选蛋白GhFLA与GhMAPKKK2存在互作关系。本研究结果为解析GhMAPKKK2调控棉花抗黄萎病反应分子机制及调控网络提供了重要参考。

靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选

【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子,在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术(virus-induced gene editing,VIGE)筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs,并验证这些sgRNAs的特异性,为定向创制棉花agl16突变体奠定重要基础。【方法】根据在棉花YZ-1中A亚组和D亚组上实际克隆GhAGL16的基因组序列,预测了3个能靶向敲除GhAGL16的sgRNAs;基于棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus,CLCrV)介导的VIGE系统,构建3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体;利用qPCR检测Cas9超表达(Cas9 over-expression,Cas9-OE)植株中Cas9的表达量,确定Cas9是否稳定遗传表达;将3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体分别转化Cas9-OE棉花子叶,并通过PCR/RE方法检测3个靶点的突变情况;利用生物信息学方法分析3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构;对突变植株进行Hi-TOM高通量测序,明确基因编辑效率。同时,对转化GhAGL16-sgRNA2的突变植株进行脱靶率鉴定,检测基因编辑的特异性。【结果】成功构建了3个能同时靶向敲除GhAGL16-A亚组和GhAGL16-D亚组序列的sgRNAs。对不同Cas9-OE植株中Cas9表达量检测结果表明,Cas9在不同Cas9-OE棉株中稳定表达。用3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体转化Cas9-OE棉花子叶,PCR/RE突变检测结果表明,GhAGL16-sgRNA2可有效用于GhAGL16的靶向敲除,在棉花A亚组和D亚组靶位点上出现了不同碱基缺失的突变类型,而GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3是2个无效sgRNA。3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构分析结果表明,GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3可能存在引导序列容易与其他序列发生配对并且不易解链的现象,干扰了引导序列对目标位点的识别,导致sgRNA无效。进一步量化GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率,对每一株转化CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA2的Cas9-OE植株突变检测结果表明,在转化的9株Cas9-OE植株中有6株发生了突变,突变效率为66.67%。此外,Hi-TOM高通量测序结果表明,GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率为13.69%—54.42%。脱靶率鉴定结果表明,预测的4个潜在脱靶位点都没有发现脱靶现象,说明GhAGL16-sgRNA2不仅具有高效的基因编辑效率,而且具有专一的基因编辑特异性。【结论】利用CLCrV介导的VIGE系统转化Cas9-OE棉花筛选获得1个能高效敲除GhAGL16的sgRNA,为定向创制棉花agl16突变体提供了理想的sgRNA。

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化

【目的】建立并优化葡萄种质资源稳定的ISSR-PCR体系,为葡萄种质资源研究和种质创新奠定基础。【方法】以新疆22个葡萄种质资源叶片为材料,采用改良CTAB法提取葡萄基因组DNA,并利用单因素法对影响ISSR反应体系中的各个影响因子进行优化。【结果】优化的最佳ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 30 ng,dNTPs 0.3 mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,反应体系为25.0μL。【结论】优化了新疆葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系中的各个影响因子,利用该体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可以用于葡萄种质资源遗传多样性分析。

甜菜SSR反应体系优化及重要农艺性状分子标记

【目的】为选育优质甜菜新品种,利用SSR法筛选与高糖、高产、耐盐相关的分子标注。【方法】研究对甜菜SSR-PCR反应体系进行优化,并利用SSR分子标记方法和分离群体分组分析法(Bulked Segregate Analysis,BSA)对具有高糖/低糖、低产/高产、耐盐/不耐盐三种重要农艺性状的甜菜亲本和F2代植株进行分析。【结果】研究建立了适宜甜菜的SSR-PCR反应体系为:20μL反应体系中含1×Buffer、2.0 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.5μmol/L引物、60 ng DNA模板。依据优化体系,对不同农艺性状的甜菜亲本与F2代进行SSR-PCR扩增分析,高糖性状获得了200和100 bp两条与高糖性状连锁的标记,250和230 bp两条与高产性状连锁的标记,550、250和100 bp三条与耐盐性状紧密连锁的分子标记。【结论】研究获得的7条特异条带是与甜菜重要农艺性状连锁的分子标记,将为甜菜的育种工作提供重要的理论基础。

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。

浅谈学生参与实验准备对提高教学质量的重要作用

充分的实验准备工作是实验教学工作正常开展的有力保障,也是提高实验教学质量的重要环节之一。而以学生为主体,开展实验准备工作,不仅仅可以提高学生的实践动手能力,还可以大大减轻实验老师的工作量。本文将从以前实验准备、目前准备状况及其对提高教学质量的重要作用等几个方面进行浅析,希望对培养具有创新能力的人才提供参考和借鉴。

棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析

【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6,并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究,为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据,筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6,对其序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在黄萎病诱导下的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框(ORF)为258 bp,编码85个氨基酸残基,理论等电点(pI)为9.34,脂肪系数为73.41,平均疏水性为-0.793,相对分子质量为9.86 kD,不稳定指数为73.41,为亲水性、碱性的非跨膜蛋白,无信号肽,定位于细胞核,在第11~63氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上,说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照(未侵染处理,CK)极显著下调(P<0.01),72 h时显著上调(P<0.05,下同),24和48 h时与CK无显著差异(P>0.05)。与阴性对照植株TRV:00相比,GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重,病情指数显著升高,茎秆的褐变程度更严重,且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染,当抑制GhMYB6基因表达后,棉花对黄萎病菌的敏感性增强,抗性明显降低,推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。

生物技术综合实验多维度考核体系的建立与实践

分析了以往的生物技术综合实验考核方式存在的局限性,阐述了改革传统实验考核方法的必要性,并建立了新的促进教与学、有利于培养学生实验能力、提高实验教学水平和质量的多维度实验考核方法。结果表明,多维度的考核体系能够调动学生的学习积极性,保证了考核的客观性及公平性,促进了学生综合能力的提高。

加强高校实验室管理 促进应用型人才培养

实验室是高等院校作为学生检验理论学习的重要基地,更是培养学生成为创新型人才的重要场所。文章通过分析当前实验室存在的突出问题如设备陈旧、仪器供需不匹配、使用率低等现象。从实验室建设与管理、实验室的开放、仪器共享等几个方面,探讨了在实验室管理及实验教学过程碰到的问题及采取的有效措施。

浅谈学科竞赛在农科类实践教学中发挥的重要作用

学科竞赛对培养学生创新能力、实践能力和实践教学改革等方面都具有重要作用。本文探讨了目前实践教学的重要性及存在的问题,并从学科竞赛对农科类实践教学的改革、优秀大学生的培养、实验室开放等方面发挥的重要作用及存在的弊端几个方面进行了论述,供大家借鉴。

《酶工程》课程建设规划的研究

《酶工程》是生物技术专业的重要专业课之一,为了提高生物技术专业人才培养的质量,更好地满足现代企业对人才的需求。本文以《酶工程》课程建设为研究对象,系统地阐述了该门课程的建设目标和具体实施方案,以期为本专业及其他相关专业课程建设规划的制定奠定一定的基础。

论《生物技术引论与实验》课程说课模式的设计

说课活动作为连接教学与教研、备课与上课的中间桥梁,是以教师上好课为出发点,以教师之间相互交流为纽带的开放型教研活动.《生物技术引论与实验》是一门实验技能培训课程,文章按说课要求着重从课程性质与定位、教学目标、内容设计及教学方法与手段等几个方面叙述与探讨,旨在与同行教师进行教学交流,提高教学质量,能更好地体现说课的价值.

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥GGB基因突变体的鉴定

GGB是抗旱负调控基因。为了获得拟南芥ggb突变体材料,构建了以拟南芥U6启动子驱动GGBsgRNA的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。将构建好的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。对转基因后代GGB基因的测序结果分析发现,在靶位点处有缺失4个碱基和增加1个T碱基的2种突变体产生。分别对野生型拟南芥和上述2种ggb突变体进行半定量RT-PCR分析结果显示,突变体材料中几乎检测不到GGB基因表达,说明获得了GGB基因敲除突变体。对野生型和ggb突变体叶片失水率、耐旱表型及单株种子量的测定结果表明,与野生型相比,拟南芥GGB基因突变后,叶片失水率显著减少,抗旱性明显增强,而单株种子量却并没有改变。研究表明,GGB是一种理想的作物分子育种的候选靶基因,获得的突变体为今后从农作物中克隆的GGB同源基因进行功能互补验证提供了有用的遗传材料。

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具,目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子,分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料,制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sg RNA和CAMV35S::Cas9两部分),并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR,成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序,结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主,少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能,为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。

棉花bZIP转录因子基因GhbZIP15的克隆与表达分析

b ZIP转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。本研究依据生物信息学分析,采用RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)方法从棉花中克隆了一个b ZIP转录因子基因,命名为Ghb ZIP15(Gen Bank登录号为KP938299)。该基因c DNA全长1980 bp,其开放阅读框为966 bp,编码321个氨基酸的蛋白,预测分子量为37.1 k D,等电点为7.44。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有b ZIP家族典型的BRLZ碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B-zip1家族。系统进化树分析表明Ghb ZIP15属于b ZIP转录因子AREB亚家族,和拟南芥A亚家族的Atb ZIP12,At ABF1和At ABF2亲缘关系最近。洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明,Ghb ZIP15主要定位于细胞核中。RT-PCR分析表明Ghb ZIP15对干旱、高盐、低温等处理都有一定程度的响应,推测该基因对棉花非生物胁迫的调控起重要作用。

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。

不同活力花粉与其内含物及水分含量的变化及相关性研究

【目的】研究花粉内含物的变化与花粉活力之间的关系。【方法】在4℃下贮藏砀山梨花粉,离体萌发法测定花粉活力,近红外光谱仪测定花粉的蛋白质、脂肪、硫甙、水分含量。【结果】随着花粉活力的下降,花粉中总蛋白质含量的增加,总脂肪含量呈锯齿状,硫甙含量呈锯齿状,含水量呈上升趋势。花粉活力与脂肪、硫甙、含水量与蛋白质之间有相互关系,花粉活力与脂肪r为0. 623**,花粉活力与硫甙r为0. 813**;花粉活力与含水量r为-0. 886**,花粉活力与蛋白质r为-0. 807**。【结论】脂肪、硫甙与花粉活力正相关,含水量、蛋白质与花粉活力呈负相关,花粉储藏应干燥以降低花粉呼吸代谢。

木纳格葡萄胚挽救影响因素的研究

以花后不同天数的木纳格葡萄败育型胚珠为试材,研究接种时期、基本培养基种类、不同激素、胚珠处理方式以及活性炭浓度对胚挽救中木纳格葡萄胚萌发的影响。结果表明,木纳格葡萄在开花后第40天是胚挽救的最佳时期,胚萌发率可高达76.8%。对胚珠进行横切处理,在6-BA 1.0mg/L,GA30.2mg/L,IBA 1.0mg/L,活性炭0.5g/L的Nitsch培养基中,木纳格葡萄胚萌发率最高。

低温胁迫对三种早春短命植物生理生化指标的影响

【目的】以三种新疆早春短命植物绵果荠、卷果涩荠和粗果庭荠苗期叶片为试验材料,分别测定4℃低温胁迫处理对各材料抗冷性生理生化指标的影响,鉴定三种植物的抗冷能力。【方法】在苗期对三种植物进行4℃低温胁迫处理,分别测定处理0、3、6、9、12、15、18、21和24 h时各材料叶片内相对电导率、丙二醛含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和相关酶活性的变化,使用隶属函数法确定各植物的抗冷性大小。【结果】随着胁迫时间的延长,三种植物苗期叶片中相对电导率、丙二醛含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD酶活性及POD酶活性变化趋势相同,均呈逐渐上升的趋势,但变化率存在差异;使用隶属函数值分析,三种植物的抗冷性从大到小依次为:卷果涩荠>绵果荠>粗果庭荠。【结论】单一生理生化指标很难反映植物抗冷能力,试验所选指标中相对电导率、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD酶活性及POD酶活性能较好反映各材料的抗冷性大小,可作为早春短命植物抗冷性鉴定的参考指标,对抗冷种质资源发掘及抗逆育种有一定指导意义。

过表达GH3-5提高拟南芥抗旱的分子机制

[目的]拟南芥GH3-5和GH3-6基因属于生长素早期应答基因GH3基因家族。GH3-5基因过表达植株gh3.5-1D和GH3-6基因过表达植株dfl1-D都表现出生长素响应缺失的表型,然而与野生型对照相比两者的抗旱能力却完全相反。研究GH3-5基因的抗旱机制,将能解释两者抗旱表型完全相反的原因。[方法]采用液相色谱-质谱联用技术测定了干旱胁迫后gh3.5-1D、dfl1-D及其对应野生型中水杨酸的含量,同时检测了gh3.5-1D/Nah G和gh3.5-1D/npr1两种双突变体的抗旱性。[结果]与野生型相比,干旱胁迫后dfl1-D中水杨酸(SA)的含量没有差异,而gh3.5-1D中SA的含量增加了1倍。进一步研究发现,gh3.5-1D较高的抗旱能力在gh3.5-1D/Nah G双突变体中丧失,而在gh3.5-1D/npr1双突变体中没有明显变化。[结论]水杨酸的过量积累是gh3.5-1D抗旱性发生逆转的原因,然而这种SA赋予的抗旱性可能并不依赖NPR1。