利福平耐药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物表型耐药与其基因突变的一致性研究

目的:研究利福平耐药结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones,FQs)耐药基因突变特征与FQs最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的关系。方法:选取2016—2021年北京市结核病防治机构及定点医院收治的利福平耐药结核病(rifampicin resistant tuberculosis,RR-TB)患者分离培养阳性菌株进行微孔板法药物敏感性检测,总结RR-TB患者菌株对左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)的MIC值;同时进行一代测序。分析FQs耐药相关基因gyrA和gyrB突变特征与FQs MIC之间的关系;以表型药物敏感性试验(phenotypic drug susceptibility testing,pDST)结果为参照标准,评价基因型药物敏感性试验(genotypic drug susceptibility testing,gDST)对FQs耐药的检测效能;探讨RR-MTB对FQs表型耐药与基因型耐药差异的原因。结果:303株RR-TB患者菌株中,FQs pDST耐药率为27.7%(84/303),gyrA基因突变检出率为25.1%(76/303),未检测到gyrB基因突变。以pDST结果为参照标准,gDST检测RR-MTB的FQs耐药性的敏感度和特异度分别为84.5%(71/84;95%CI:74.6.1%~91.2%)和97.7%(214/219;95%CI:94.5%~99.1%)。两种方法结果不一致的菌株有25株,不一致率为8.3%(25/303)。FQs耐药菌株的MIC主要为2μg/ml,最常见的突变位点发生在第94位点(53.9%,41/76),gyrA基因在第88和94位点突变与pDST耐药完全一致,而第90和91位点突变的pDST耐药一致率分别为95.8%(23/24)和3/5。第88位点的突变与Lfx pDST耐药相关,与Mfx pDST高浓度耐药相关;第90位点的突变以丙氨酸转变为缬氨酸为主(92.3%,24/26),该突变发生的Lfx和Mfx最低MIC为临界浓度(1μg/ml和0.25μg/ml)。第94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺均为Lfx和Mfx高浓度耐药(1/1),该位点天冬氨酸突变为酪氨酸与Lfx耐药(1/1)相关,与Mfx高浓度耐药相关(1/1)。结论:北京地区RR-MTB的FQs耐药的主要机制是gyrA基因突变,不同gyrA基因突变提示FQs耐药水平存在差异。FQs pDST和gDST检测RR-MTB的结果高度一致,可及早应用gDST检测RR-TB患者的FQs的耐药性,以指导临床制定合理治疗方案。

17种抗生素对北京地区快速生长分枝杆菌体外抑菌效果分析

目的:分析17种抗生素对北京地区快速生长分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria,RGM)临床分离株的抑菌效果,为RGM引起的非结核分枝杆菌病的临床治疗提供可靠的理论依据。方法:收集北京市疾病预防控制中心结核病实验室2016年1月至2020年12月五年间分离保存的130株非结核分枝杆菌菌株,对其进行菌种鉴定。对鉴定出的RGM临床分离株和相应标准株复苏后,采用微量肉汤稀释法进行17种药物(阿米卡星、环丙沙星、磺胺甲噁唑-甲氧苄啶、克拉霉素、利奈唑胺、莫西沙星、多西环素、米诺环素、头孢西丁、替加环素、妥布霉素、亚胺培南、美罗培南、阿莫西林/克拉维酸、贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明)的敏感性试验,记录其最低抑菌浓度(MIC)及抑制50%或90%受试菌的MIC值(MIC90和MIC50)。结果:经菌种鉴定且复苏成功的RGM为37株,包括19株脓肿分枝杆菌、17株偶发分枝杆菌和1株龟分枝杆菌。已明确耐药折点的14种抗生素中,所检测的3种RGM临床分离株对替加环素均敏感,龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌临床分离株对克拉霉素均敏感,脓肿分枝杆菌临床分离株对利奈唑胺敏感。另外,偶发分枝杆菌临床分离株对阿米卡星、环丙沙星、磺胺甲噁唑-甲氧苄啶、莫西沙星对均敏感。脓肿分枝杆菌临床分离株对阿米卡星的敏感率为73.7%(14/19),偶发分枝杆菌临床分离株对利奈唑胺、美罗培南敏感率分别为82.4%(14/17)、88.2%(15/17)。所检测的19株脓肿分枝杆菌对多西环素、阿莫西林/克拉维酸均耐药,偶发分枝杆菌临床分离株对妥布霉素均耐药。此外,贝达喹啉和氯法齐明对RGM临床分离株的MIC90均小于药敏板最低检测限值,而德拉马尼的MIC90均高于药敏板最大检测限值。结论:替加环素、阿米卡星、利奈唑胺、贝达喹啉和氯法齐明对RGM均具有较好的体外抑菌活性,而多西环素、阿莫西林/克拉维酸、德拉马尼几乎没有体外抑菌活性。非结核分枝杆菌种间耐药谱差异较大,建议用药前进行菌种鉴定和药物敏感性试验,以选择合适的抗菌药物。

H5N1型禽流感病毒感染非人灵长类动物的观察

目的观察H5N1型禽流感病毒对中国非人灵长类动物的易感性并建立动物模型。方法将病毒通过滴鼻接种实验猴,观察感染后动物的临床症状,采血、咽拭子及各器官组织进行血清学、病原学及病理学检查,记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变。结果感染后动物表现轻度食欲下降、一过性体温升高及外周血白细胞减少,肺组织病毒分离及RT-PCR阳性,病理检查感染急性期动物肺组织表现为间质性肺炎,肺泡间隔增宽,充血出血明显,肺泡受压变形,间质及肺泡内有大量炎细胞浸润,符合病毒性肺炎的改变,感染后14 d动物血清IgG抗体水平较感染前升高4倍。结论H5N1病毒可感染非人灵长类动物,可以作为感染模型进行H5N1病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。

四种方法联合检测对病原学阴性肺结核的诊断价值

目的:分析结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核抗体(antibody,TB-Ab)、血红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、超敏C-反应蛋白(high-sensitivity C-reaction protein,hs-CRP)联合检测在病原学阴性肺结核诊断中的价值。方法:收集2020年7月至2022年7月北京市疾病预防控制中心结核病门诊收治的初治且病原学检查阴性的肺结核患者216例(病原学阴性肺结核组),以及同期收治的病原学阳性的初治肺结核患者147例(病原学阳性肺结核组)和其他肺部疾病患者455例(其他肺部疾病组)。均行T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、CRP检测,以临床诊断为标准,分析四种方法单独及联合检测的诊断效能。结果:T-SPOT.TB在病原学阴性肺结核组中检测阳性率为82.4%(178/216),与病原学阳性肺结核组阳性率[87.8%(129/147)]相比较,差异无统计学意义(χ2=1.917,P=0.166),与其他肺部疾病组阳性率28.6%(130/455)相比较差异有统计学意义(χ2=160.746,P=0.000)。T-SPOT.TB对病原学阴性肺结核诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为82.4%(178/216)、71.4%(325/455)、57.8%(178/308)、89.5%(325/363)、75.0%(503/671);四种方法联合诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为91.7%(198/216)、53.4%(243/455)、48.3%(198/410)、93.1%(243/261)、65.7%(441/671)。T-SPOT.TB、TB-Ab、ESR、hs-CRP检测ROC曲线下面积(AUC)分别为0.764、0.600、0.529、0.515,联合检测的AUC为0.804。结论:T-SPOT.TB检测病原学阴性肺结核的敏感度、阴性预测值及准确度较好,四种方法联合检测的敏感度、阴性预测值和AUC较高,联合检测可提高病原学阴性肺结核的诊断效能。

非人灵长类动物胃镜检测技术的建立

目的建立非人灵长类动物胃镜检测技术。方法复方氯胺酮麻醉动物,将内镜经口腔、咽依次进入食管、胃、十二指肠,观察粘膜状况后在胃、十二指肠分别取材,术后清洗消毒内镜,动物即时苏醒。结果内镜顺利进入食管、胃及十二指肠,进镜深度分别约10 cm、30 cm5、0 cm,各段粘膜光滑平整,未见明显异常。术后动物未发生不良反应及并发症。结论非人灵长类动物胃镜检测技术的建立,为研究非人灵长类动物上消化道疾病搭建了良好的技术平台。

H5N1型禽流感病毒动物模型的研究现状

H5N1亚型禽流感病毒在全球多个国家肆虐,已严重威胁人类健康。禽流感病毒动物模型的建立可以为研究病毒的突变、传染性和发病机制提供良好的技术平台。本综述概括了H5N1对几种哺乳动物:食蟹猴、雪貂、小鼠、大鼠、沙鼠、家猫等的致病性,为以后理想动物模型的建立和研究提供一定的帮助。

浅谈实验动物病理检测

实验动物病理检测是实验动物质量监督检验的重要环节,病理学研究是对实验动物质量综合评估的最好方法 ,针对目前的检测现状,本文在制定实验动物病理检测标准的重要性、病理检测内容以及检测标准的制定原则方面进行了讨论。

初治病原学阳性肺结核患者细菌学与免疫学指标动态变化分析

目的分析初治病原学阳性且利福平敏感肺结核患者不同阶段T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核抗体与痰涂片+培养检测动态变化及临床意义。方法收集2020年8月至2021年5月北京结核病控制研究所门诊收治的肺结核患者34例,分别于治疗前、治疗2月和6月行以上方法检测。结果34例患者,疗前痰涂片+培养、T-SPOT.TB、结核抗体阳性检出率分别为85.29%、100%、76.47%;治疗2月阴转率分别为89.66%、5.88%、11.54%;治疗6月阴转率分别为100%、23.53%、26.92%。治疗前、治疗2月和6月之间T-SPOT.TB试验结核特异性抗原与植物血凝素(TBAg/PHA)比值差异均有统计学意义(P值均<0.05),治疗前与治疗2月或6月痰涂片+培养差异有统计学意义(P值均<0.05),结核抗体差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论在有效抗结核治疗6月后,肺结核患者的T-SPOT.TB试验TBAg/PHA比值显著降低;结核抗体不能很好地反映疗效情况;痰涂片+培养亦能够很好地反映疗效。

高致病性禽流感(H5N1)实验流行病学初探——感染途径

目的观测不同感染途径实验性感染BALB/c小鼠后的感染状况,了解H5N1病毒的感染特点,为更深入的流行病学研究提供理论基础。方法分别通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射、皮肤损伤途径感染6-8周龄BALB/c小鼠,定期安乐动物采血及各器官组织进行血清学、病原学、病理学检查,记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变。结果各途径感染小鼠感染后出现竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状,肺组织病毒分离及RT-PCR阳性,病理表现间质性肺炎。感染后第7 d动物血清中可检测到H5N1抗体。结论通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射及皮肤损伤多种途径感染BALB/c小鼠,均能发生感染,提示呼吸道以外的感染方式不容忽视,有益于人类更好的防控禽流感;可通过多种方式建模,深入研究禽流感的发病机制。

甲苯胺蓝在组织染色中应用范围的拓展

目的 推广甲苯胺蓝在组织染色中的应用.方法 取大鼠皮肤、肺脏、气管、大脑及脊髓等组织,4%甲醛固定后常规切片,分别进行甲苯胺蓝染色,镜下观察各组织细胞的特点.结果 经甲苯胺蓝染色,除神经元的尼氏体清晰显示外,皮肤的朗格汉斯细胞与黑素细胞及梅克尔细胞,肺脏的Ⅰ型、Ⅱ型肺泡细胞及巨噬细胞,气管的纤毛细胞和杯状细胞均得到不同程度区分,大脑皮质的分层也更加清晰.结论 甲苯胺蓝染色可应用于皮肤、肺脏、气管、大脑及脊髓组织,拓展了传统应用范围.

丰益菌剂处理对玉米种子萌发及幼苗生长的影响

采用丰益菌剂对郑单958玉米种子分别进行拌种和浸种处理,拌种时按菌剂:种子分别为1:15、1:20、1:25的比例进行拌种,浸种时将丰益菌稀释50、100、200倍分别浸泡种子24h,然后进行萌发试验,测定萌发5d后的发芽率、根数、苗长、根长、幼苗鲜重和干重及叶片中SOD和POD的含量。研究结果表明,1:15拌种处理效果较好,拌种处理以后适宜的田间相对土壤湿度为65%。

盐度对南美白对虾的生长及生化成分的影响

在室内不同盐度条件下进行了南美白对虾(Penaeusvannamei)幼虾饲养试验 ,就盐度对南美白对虾生长、成活率及生化成分的影响进行了研究。结果表明 ,盐度对南美白对虾体质量增长率、成活率、饲料系数有显著影响(P<0.05) ;在盐度为20时 ,南美白对虾生长最好 ,不同盐度条件下 ,南美白对虾体内的蛋白质、水分、氨基酸。

马蔺种子休眠机理的研究

为进一步分析马蔺种子的休眠机理,对马蔺种子种皮透水性、种胚发育状况、萌发抑制物质以及暖层积(25℃)期间的一些相关指标进行了测定,结果表明:马蔺种子种皮及胚乳组织较致密,种子吸水缓慢,种皮携带萌发抑制物质;暖层积之后种子内的萌发促进物质GA3含量上升,抑制物质ABA含量下降,种皮萌发抑制物质消失,发芽率显著提高。综合以上结果可以看出,马蔺种子属于综合休眠,种皮对种子萌发有限制作用,种胚存在生理休眠。

人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血的治疗作用

目的评价人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血模型的治疗作用。方法符合普通级标准的成年食蟹猴12只,用自体股动脉抗凝血脑内注射方法建模后1周,用脑立体定位法在血肿周围植入人骨髓间充质干细胞,细胞数分别为高剂量5×106、低剂量1×106、对照组等体积生理盐水。利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对干细胞移植效果进行评价。结果神经功能评分显示干细胞移植1周后动物神经功能明显改善。PET结果显示干细胞移植后2周高剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间存在显著性差异(P=0.02)。移植后3周高、低剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV%值与对照组间差异存在显著性(P值分别为0.03和0.04)。MRI显示剂量组血肿吸收速度大于对照组。病理检查可见剂量组坏死灶面积小于对照组,出血灶周围有大量新生血管生成,剂量组与对照组间差异存在显著性(P<0.01)。结论在损伤脑组织周围移植hBMSC可促进食蟹猴损伤神经组织的恢复,为hBMSC治疗脑出血的临床应用提供了重要实验依据。

常用近交系小鼠微卫星DNA多态性的分析研究

目的用微卫星引物对常用近交系小鼠进行遗传监测和DNA多态性分析。方法通过Genome Database选取位于小鼠不同染色体上的15个微卫星位点,应用PCR扩增技术对近交系小鼠C57BL/J、DBA/2、C3H、BALB/c、129、FVB、SCID进行微卫星DNA多态性的分析。结果 15个微卫星位点除D8Mit113、D13Mit88无扩增条带外,其余13个微卫星位点引物对七种近交系小鼠均有稳定扩增,同一品系不同个体之间表现为单态性;不同品系个体之间表现为多态性。结论所用微卫星位点具有信息含量高、分布广、扩增稳定、高度多态性的特点,各位点PCR的稳定扩增,依其DNA多态性的特点来判定各品系间的遗传差异,是一种准确客观、方便快速的遗传监测方法。

阿尔茨海默病中mir-34a作用机制的探讨

目的探讨mir-34a在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time RT-PCR对芯片结果进行验证;采用western blot的方法检测APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl2蛋白的表达情况;通过构建mir-34a稳定转染细胞系和mir-34aknockdown研究mir-34a与bcl2之间的关系;通过构建bcl23’UTR-荧光素酶报告载体,验证bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结果mir-34a在模型小鼠中表达水平明显升高,并且其表达水平与bcl2蛋白水平呈负相关;通过体外实验,我们发现mir-34a过表达可以明显降低bcl2蛋白水平,反之,当我们抑制mir-34a的表达以后则可以增加bcl2蛋白水平;荧光素酶报告载体实验表明bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结论bcl2可能是mir-34a重要的功能靶点,mir-34a的过表达可能通过下调bcl2的蛋白水平,从而参与AD的发生。

阿尔茨海默病模型小鼠凋亡相关蛋白的表达

目的探讨阿尔茨海默病(AD)凋亡相关蛋白的表达情况。方法取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,利用Western印迹的方法检测APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2、caspase-9以及caspase-3的表达情况。结果与同月龄的对照小鼠相比,APPswe/PSΔE9转基因小鼠中,bcl-2表达水平明显降低,而caspase-9和caspase-3表达水平明显升高。结论凋亡相关蛋白的异常表达可能在AD的发生发展过程中起到一定作用。

H5N1禽流感病毒感染小鼠和两种灵长类动物的肺组织病理学比较

目的比较H5N1禽流感病毒感染小鼠、恒河猴及食蟹猴急性期肺组织的病理学变化。方法在麻醉状态下对BALB/c小鼠、恒河猴及食蟹猴进行H5N1病毒滴鼻接种,在感染急性期实施安死术,取肺组织运用H&E结合免疫组化技术分析肺组织的病理变化。结果BALB/c小鼠感染急性期,肺组织以变质性炎为主,肺泡结构被广泛破坏,以单核细胞为主的炎细胞浸润,局部可见渗出性炎。而在恒河猴感染急性期肺组织病理改变以渗出性炎为主,同时可见变质性炎和增生性炎。在食蟹猴感染急性期肺组织病理改变以渗出性和变质性炎为主,同时亦可见上皮的新生。结论H5N1禽流感病毒感染小鼠与恒河猴、食蟹猴急性期肺组织的病理变化不同,这将为进一步认识禽流感的发病机制及研究针对性的治疗方法提供一些理论依据。

人骨髓间充质干细胞移植对食蟹猴脑出血模型损伤的修复作用

目的观察人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)移植4周和8周后,对食蟹猴脑出血模型脑组织损伤的修复作用。方法在脑定位仪定位下,通过自体血注入法制成食蟹猴脑出血模型,并将其随机分为高剂量治疗组、低剂量治疗组和模型组,分别在脑出血部位附近注入高、低密度的hMSCs和生理盐水。应用整体病理切片扫描、HE染色及免疫组织化学的方法观察hMSCs移植治疗食蟹猴脑出血4周和8周后脑损伤部位的病理变化。结果脑出血模型组可见脑出血损伤部位脑组织大面积变性坏死,多量吞噬含铁血黄素的泡沫细胞增生,周围少许肉芽组织增生伴局部纤维组织形成。hMSCs治疗组,整体切片扫描结果提示,与模型组相比,hMSCs低剂量及高剂量治疗组均可见脑组织变性坏死范围减小,且低剂量治疗组略好于高剂量治疗组;HE染色可见大脑注射部位局部脑组织变性坏死、吞噬含铁血黄素的泡沫细胞增生,周围肉芽组织增生伴局部纤维组织形成。免疫组化发现治疗组出血区内可见神经巢蛋白(Nestin)阳性细胞内散在分布,而在模型组中呈阴性表达。结论hMSCs可促进食蟹猴脑出血脑组织损伤的修复,且治疗效果可能与治疗剂量有一定相关性。

近交系小鼠微卫星DNA引物的筛选和Tm值优化研究

目的通过对近交系小鼠微卫星引物的筛选和Tm值优化研究,以探索小鼠DNA多态性检测方法。方法随机选用32对位于小鼠不同染色体的微卫星引物,用PCR扩增方法对常用C57BL/6、C3H、BALB/c、DBA/2、129、FVB及SCID近交系小鼠DNA多态性进行扩增和电泳分析,并对其中25对引物的Tm值进行优化。结果 25对引物可稳定扩增,2对引物在不同品系小鼠间表现为单态性,23对引物在不同品系间呈多态性,10对引物呈显著多态性(3～4个态性)。结论所筛选和优化的25对微卫星引物,对不同品系小鼠DNA可稳定扩增,其电泳结果具有较高的DNA多态性,可反映不同品系小鼠的遗传概貌。