sRNA RybB缺失后沙门氏菌的转录组分析

为了探明沙门氏菌在sRNA RybB缺失后的转录组变化情况,试验对沙门氏菌LT2菌株和RybB基因缺失株进行高通量测序,运用DESeq2算法筛选sRNA RybB缺失后的差异表达基因,并对其进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析及EggNOG功能注释,并利用实时荧光定量PCR验证筛选出的10个差异表达基因结果的可靠性。结果表明:共筛选出199个差异表达基因,其中上调基因98个,下调基因101个。差异表达基因GO功能主要注释了酰胺转运、肽转运、大分子蛋白定位等生物学过程,参与了鞭毛组装、双组分系统、沙门氏菌感染、丙酸代谢和NOD样受体信号通路等27个KEGG信号通路,EggNOG功能注释了细胞壁/膜/包膜生物发生、一般功能预测、碳水化合物运输与代谢、氨基酸的转运和代谢等蛋白分类。差异表达基因STM1049、STM1246、STM4504、STM1394、STM1050、STM3600、STM3599、STM3601、STM3598和STM3602的相对表达量与转录组测序结果的变化趋势一致。说明sRNA RybB缺失后会影响细菌的生命活动,以及可直接或间接调节沙门氏菌的各种代谢途径。

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对Ⅲ型分泌系统相关基因的调控

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株,通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示:与标准菌株相比,gcvB缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调;prgJ、prgK的转录水平上调,蛋白水平下调。hfq缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调,prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。

沙门菌伴侣蛋白Hfq及RybB对外膜蛋白相关基因fadL、ompN、ybfM的作用

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用,利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株,通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失,进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明,Hfq抑制ybfM、ompN的表达,但fadL的表达上调;RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达,但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时,对ompN、ybfM的表达具有抑制作用,但fadL的表达上调,且Hfq的调控作用总体大于RybB.

抗鸽巴氏杆菌的中药有效成分筛选

本文旨在筛选中药有效成分用于抗鸽巴氏杆菌。筛选菊芋、苦参碱、银杏叶黄酮粗提物等9种中药成分,采用药敏纸片法对鸽巴氏杆菌进行体外抑菌试验,然后选出其中抗菌活性较强的中药成分,通过二倍体试管稀释法测出中药有效成分对多杀性巴氏杆菌的最低抑菌浓度。药敏试验结果显示,硫酸黄连素等5种中药成分对鸽巴氏杆菌具有显著的抑菌效果,白头翁提取物等4种中药成分无明显抑菌效果。其中,硫酸黄连素、盐酸小檗碱、艾叶提取物、黄芩苷、苦参碱最低抑菌浓度依次为26.25、0.16、0.47、0.25、6.25mg/ml。结论:本试验筛选了5种效果较好的抗巴氏杆菌中药有效成分,其中盐酸小檗碱和黄芩苷抑菌效果最好,为临床防治鸽巴氏杆菌病提供新的治疗方法。

鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析

旨在探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点,本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株,构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因编码蛋白水平。预测结果显示,GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U_(5)和U_(8)。qRT-PCR结果显示,U_(5)基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化,而gcvB基因转录水平随U_(8)基序的截短而下调,截短为U_(5)和U_(4)时下调最为明显,分别下调40.5%和37.5%。延伸U_(4)截短菌株的GcvB终止子茎,结果发现,gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平,同时也发现,尽管U_(4)截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复,却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明,U_(5)基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U_(8)基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性是重要的,推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。

鼠伤寒沙门氏菌LT2 Hfq与fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR结合位点的预测与验证分析

通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株,运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株,通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示,fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量,分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量,分别提高了1.29、1.30、1.07倍,ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化,分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明,ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调,部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.

鼠伤寒沙门氏菌STM LT2 Hfq关键作用位点的分析

为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平。Western blotting结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均不同程度地上调了Hfq蛋白水平。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使GcvB基因转录水平下调。β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度地上调了oppA蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变及Hfq C-端分别截短至第65和72位氨基酸时oppA蛋白水平上调最为明显,分别上调了2.9、3.3和2.0倍。以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性非常重要,Hfq近端面第56位氨基酸及Hfq C-端第65-87位氨基酸与oppA蛋白水平呈负相关。

鼠伤寒沙门菌ompA基因缺失株的构建及生物学特性的分析

为探究外膜蛋白基因ompA对鼠伤寒沙门菌的生物学特性及对毒力的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建ompA基因缺失株,通过比较检测生长曲线、运动性、生化特性、生物被膜形成能力、耐药性、细胞粘附性以及半数致死量(LD50)来检测野生株与基因缺失株之间的区别。结果显示,野生株与ompA缺失株的生长曲线、运动性、生化特性无明显区别;ompA缺失株的生物被膜形成能力极显著下降,对多种抗生素的敏感性增加,对细胞的粘附性和侵袭力均下降约79%;LD50的测定结果显示,STM LT2的LD50显著低于ompA缺失株,说明ompA的缺失显著降低了沙门菌对小鼠的致病力。综上所述,ompA的缺失能影响鼠伤寒沙门菌的部分生物学特性。以上结果为进一步研究外膜蛋白基因ompA基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了理论基础。

沙门菌sRNA GcvB及伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的调控作用

为探究sRNA GcvB与伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的调控作用,通过λred同源重组、FLP/FRT重组和转导构建了基因缺失菌株Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat,并通过β-半乳糖苷酶(LacZ)试验和荧光定量PCR试验测定了gcvB与hfq缺失后LacZ活性和stm4351转录水平的变化情况.β-半乳糖苷酶试验结果显示:gcvB或hfq缺失菌株的LacZ活性均升高,表明stm4351基因的蛋白表达水平升高;hfq缺失菌株的LacZ活性高于gcvB缺失菌株;hfq和gcvB同时缺失后,LacZ活性比单缺失菌株高.荧光定量PCR结果显示:hfq缺失后,stm4351的转录量极显著下降;而gcvB缺失及hfq和gcvB同时缺失对stm4351转录量的影响不显著.以上结果说明:GcvB、Hfq均对stm4351的表达存在抑制作用;在Hfq的辅助作用下,GcvB对stm4351表达的抑制作用增强;Hfq协同GcvB对stm4351的调控途径可能有2种或更多;同时,Hfq对stm4351的保护或激活作用可能受到GcvB的影响.

sRNA SdsR敲除后沙门菌的转录组分析

sRNA SdsR是σS调节子的成员,控制着细菌全局适应性反应,为探明sRNA SdsR敲除后沙门菌的转录组变化情况,本研究利用Illumina NovaSeq 6000高通量测序技术,对沙门菌LT2标准株和sRNA SdsR缺失株进行高通量测序,全方位预测SdsR的潜在靶基因的种类和功能;采用DESeq对基因表达进行差异分析,并对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG pathway分析,进一步筛选差异表达基因行使的生物学功能以及所参与的信号途径;通过qRT-PCR验证部分差异基因结果的准确性。结果显示:对照组和实验组共筛选出25 731 760条和26 866 200条Clean Reads,DESeq差异分析获得差异基因共127个,其中基因表达量下调74个,上调53个;GO富集分析显示,显著差异表达基因主要富集在二醇分解代谢过程、乙二醇分解代谢过程等684个生物过程;KEGG pathway分析显示,显著差异表达基因主要参与丙酸代谢、双组分系统、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等27个信号途径;对筛选的10个差异基因进行qRT-PCR进行验证,结果显示,差异表达基因的mRNA转录水平与DESeq预测的结果上下调节趋势完全符合,表明测序结果可靠。本研究丰富了sRNA SdsR的靶基因数目,为进一步研究sRNA SdsR的作用机理、调控机制以及沙门菌的致病机制提供了基础。

一例犬冠状病毒性腹泻的诊疗

犬冠状病毒性腹泻又称犬冠状病毒病,是由犬冠状病毒引起的一种临床上以呕吐、腹泻、脱水及易复发为特征的高度接触性传染病.该病对幼犬危害尤其严重,病死率很高,是目前对养犬业危害较大的疾病之一.本文通过对一例犬冠状病例的治疗,说明犬冠状防控的治疗方案、预防措施的制定与应用.

沙门菌外膜蛋白相关基因缺失株的致病性

为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响,构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株,并测定了基因缺失菌株的生长曲线,同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示,与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比,基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10^(7)CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10^(5)、6.29×10^(5)、9.97×10^(5)CFU,毒性明显增强;sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10^(7)CFU,毒性有所下降;伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后,与对照组(LT2)相比,所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高;ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低,其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著;ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降,而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著;ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著,Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降,而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说,hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力,而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.

一例犬细小病毒病的诊治

文章通过对1例患犬的发病情况、临床症状,结合血常规检查、C反应蛋白检测以及犬细小病毒抗原测试纸检测,确诊为犬肠炎型细小病毒病。经过5天的治疗后痊愈,后期复查各项指标恢复正常。

鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR靶基因的预测及验证分析

【目的】筛选鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR的靶基因,为明确s RNA与靶基因的互作以及沙门菌的致病机制奠定基础。【方法】利用TargetRNA2软件预测sRNA SdsR的靶标,基于前期的s RNA SdsR敲除后转录组测序结果,将预测到的基因注释到GO、KEGG以及eggNOG数据库中进行分析,通过RT-qPCR对预测到的杂交能量较高的部分靶基因进行验证。【结果】TargetRNA2软件预测到29个靶标,其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC的杂交能量较高,且能与sRNA SdsR有连续的碱基匹配,分别与鼠伤寒沙门菌血红素合成、氧化还原过程、草酰乙酸脱羧酶的合成、膜的组成部分、细胞质蛋白的合成有关。RT-qPCR结果显示,相对于野生菌株3409,敲除s RNA SdsR后hemA、mreC的表达分别下调0.70和0.39倍;STM0951、STM1252、dcoC的表达分别上调0.51、0.35和1.86倍。【结论】hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC基因很可能受s RNA SdsR的直接调控且对某些靶基因的表达有促进作用。

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

【目的】探究小RNA(small RNA,sRNA)RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium,STM)为研究对象,将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株;在此基础上,利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type,WT)菌株相比,在lacZ报告菌株中,hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%,其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比,实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2ΔompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外,其余实验菌株均显著(P<0.05)上调,其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显,为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节;Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建,阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系,探索了Hfq对ompD的调控关键区域,丰富了sRNA的调控理论。

鼠伤寒沙门菌孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变株的构建及生物学特性分析

为探究孔蛋白基因ompW、ompS、ompD对鼠伤寒沙门菌的生物学特性及毒力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建相应突变株,通过检测生长曲线、泳动性、生化特性、体外遗传稳定性、生物被膜形成能力、耐药性、以及半数致死量(LD_(50))来比较鼠伤寒沙门菌标准菌株与各突变株之间的区别。结果显示,相比标准株,ompD和ompW基因突变株对细菌生长速率和运动能力影响较小,而ompS基因突变株的生长速率和运动能力则明显降低;3个突变株均不影响鼠伤寒沙门菌的生化特性,也不影响遗传稳定性,但能不同程度影响其对多种常用抗生素的敏感性,且均导致成膜能力极显著下降(P<0.01);LD_(50)毒力测定中,3个突变株毒力均导致鼠伤寒沙门菌的毒力下降,其中ompS基因突变株毒力下降最明显,LD_(50)为标准菌株的25倍。综上所述,孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变能影响鼠伤寒沙门菌的部分生物学特性。本研究结果为进一步研究孔蛋白ompW、ompS、ompD基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了试验基础。

鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与oppA mRNA 5′ UTR结合位点的预测与验证分析

OppA与鼠伤寒沙门菌氨基酸和肽的摄取有着重要的关系,oppA mRNA是已验证受Hfq伴侣蛋白依赖型小RNA GcvB转录后调控的靶标,GcvB与oppA mRNA的作用机制已经确认,但Hfq与oppA mRNA之间的互作机制尚未明确。为明确Hfq与oppA mRNA潜在的作用位点,分析Hfq与oppA mRNA (ARN)n基序的作用关系。本研究利用5′-RACE验证oppA mRNA转录起始位点和oppA mRNA 5′UTR,使用Mfold软件预测oppA mRNA部分序列的二级结构并根据(ARN)n基序的特征筛查oppA mRNA 5′UTR的ARN基序,利用λ-Red同源重组技术构建oppA mRNA不同(ARN)n基序敲除和突变的lacZ基因融合菌株,通过qRT-PCR试验和β-半乳糖苷酶试验的检测oppA的转录水平和蛋白表达量的变化。经验证oppA mRNA 5′UTR长度为159 bp,在oppA mRNA 5′UTR中预测到2个Hfq结合偏好型基序ARN-1和ARN-2。对ARN-1和ARN-2基序分别或同时敲除或点突变,oppA mRNA的转录水平和蛋白水平的变化呈现相似的结果。与Western blot相比,oppA基因转录和蛋白水平总体呈下调趋势。综上所述,经预测的ARN-1和ARN-2基序与Hfq转录后负调控oppA mRNA的作用机制无明显的关联,推测其为oppA mRNA翻译所需元件。