抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

吉林省部分水稻品种稻瘟病菌Pot2指纹分析

采用Pot2-rep-PCR指纹图谱法分析了吉林省部分水稻品种稻瘟病组织,发现所有病组织都能扩增出条带,扩增的片段长度为0.5～3.0kb,扩增的DNA片段数为1～6,而且各病组织在约600bp处共有1条带.经聚类分析,在80%遗传相似水平下,可将供试的15个样品分为7个谱系.不同地域同一水稻品种上的稻瘟病菌生理小种指纹不同.

稻瘟病菌群体结构的研究进展

评述了稻瘟病菌群体结构和遗传多样性及其易变性原因的研究进展 ;讨论了稻瘟病菌群体结构研究中存在的问题。

抗口蹄疫病毒策略研究进展

口蹄疫是偶蹄动物的一种烈性传染病,可使世界范围内的畜牧业遭受严重的经济损失。该病的防控方法主要包括扑杀、销毁病畜及其同群动物,对疫区内其它易感畜群和受威胁区的易感动物立即紧急接种对应型号的口蹄疫疫苗,除此之外,还需要有一些新的紧急抗病毒策略来弥补疫苗的不足,从而为易感动物及未感染动物提供及时的保护,作者着重综述了抗口蹄疫病毒策略的研究进展,主要包括IFN的应用、反义技术的应用、RNA干扰技术的应用三方面内容。

口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析

根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列,用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物,从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段,并将扩增片段分别与T载体连接,在体外分别进行了5'半分子和3'半分子的构建。最后将5'半分子和3'半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序,证实成功构建了口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA分子。序列分析结果表明,供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt,5'UTR长1059nt;具有一个大的读码框,其核苷酸长度为6969nt,包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因;3'UTR长127nt,包括34nt的poly(A)。

玉米丝黑穗病菌pra3基因的克隆及序列分析

用PCR方法克隆了玉米丝黑穗病菌pra3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明:该基因大小为1 399 bp,具有3个内含子和4个外显子。比较发现,该基因片段与Schirawski等在GenBank上发表的序列同源性为100%。

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。

口蹄疫病毒WFL株ORF基因真核表达质粒的构建及病毒的拯救

构建了FMDVWFL株ORF(open reading frame)基因真核表达质粒pEGFP-C1-A3I3,并进行了表达研究和共转染研究。结果发现,该质粒可以在BHK-21细胞中表达。将其与体外转录获得的FMDV RNA共转染BHK-21细胞后,用夹心ELISA、RT-PCR法以及电镜观察证明共转染后的细胞培养液中有病毒粒子,且病毒量高于单独转染RNA所得病毒量。证明用FMDV基因组真核表达质粒与其基因组体外转录RNA共转染敏感细胞可提高拯救病毒的数量。

口蹄疫病毒YN株VPl-2A基因的克隆及遗传变异分析

以口蹄疫病毒YN株RNA为模板，用设计的特异引物RT—PCR扩增出大小为1055bp的基因片段，并对PCR产物克隆测序进行序列分析。结果表明：供试病毒的VP1-2A基因的核苷酸序列与参考毒株的同源性为77．65％-93．00％，对应的氨基酸序列同源性为87％-97％。

口蹄疫病毒WFL株全基因组结构及遗传变异分析

目的对FMDV WFL株全基因组进行克隆及测序,并对其基因组进行了比较分析,结果表明WFL株全长为8155nt,该毒株5’UTR长1 059nt(untranslatable region,UTR),编码区核苷酸长度为6969nt,3’UTR包括93nt非编码碱基和34nt poly(A);WFL株与HKN/2002的核苷酸及氨基酸同源性最高;WFL株的polyC长17nt,其中C碱基占94.12%,仅有一个U碱基;3A基因有10个氨基酸的缺失。

玉米丝黑穗病菌的PCR检测

根据玉米丝黑穗病菌pra3基因序列设计了1对扩增玉米丝黑穗病菌的特异引物。结果显示,用该特异引物扩增玉米丝黑穗病菌DNA可以得到一条大小为499bp的目的条带,扩增玉米丝黑穗病菌DNA的灵敏度可以达到1pg,建立的PCR反应可用于玉米丝黑穗病菌的检测。

布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。

短发夹结构RNA对口蹄疫病毒2B基因瞬时表达的抑制

为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对口蹄疫病毒(FMDV)2B基因的抑制作用,针对WFL株FMDV的2B基因,设计了4个siRNA,并将shRNA表达模板插入pSilencer1.0-U6载体,构建shRNA表达质粒,将其与含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP+2B融合表达质粒瞬时共转染BHK-21细胞,以荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光表达量的变化,以实时定量RT-PCR法检测对2B基因mRNA的抑制作用。结果表明,本试验所构建的针对2B基因的shRNA表达载体可以在BHK-21细胞中抑制2B基因的瞬时表达。

开设“流式细胞术”实验课 提高研究生实践能力

流式细胞术是一门新兴的实验科学技术,广泛应用于基础研究与临床检测等领域。根据科研的需要,面向兽医学相关专业的研究生开设了流式细胞术的实验课,帮助学生深入了解了流式细胞仪的工作原理、操作方法及应用。课程中设置了"PLA2G7-EGFP质粒转染ECA-109细胞与PK-15细胞后EGFP蛋白的表达"和"小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离及B细胞的检测"两个教学范例。在课程中让学生亲自参与样本的制备,包括细胞的培养与转染、小鼠外周血的采集、单细胞悬液的制备、细胞染色、样本过滤、流式样本的上机操作、数据的获取与分析等,培养了学生的动手能力及独立操作机器的能力。并与研究生以后的科研实验相结合,提高了学生独立思考、分析问题、解决问题的能力,帮助研究生在未来的实验研究中科学规划和使用流式细胞仪。

牛布鲁菌O链A抗原的提纯鉴定及种特异性单克隆抗体的研制

应用热酚法提纯牛布鲁菌544A的O链,经Sephades G-50纯化后,琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定,用牛布鲁菌544A株全菌体免疫BALB/c小鼠,用纯化的O链筛选出4株针对O链表面A抗原的种特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9和1E2,4株单克隆抗体均不与羊布鲁菌16 M、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠伤寒沙门菌、放线杆菌发生交叉反应,具有高特异性,其中4B8的亲和常数达到了8.99×108M-1,适合用于鉴定牛种布鲁菌的研究。

猪圆环病毒2型免疫抑制机理研究进展

猪圆环病毒2型(PCV-2)致病的一个主要原因是使感染的个体产生免疫抑制,感染猪体免疫细胞受到不同程度的损伤。PCV-2可以在单核细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞中存在,影响这些细胞对于抗原的递呈。PCV-2也可在T淋巴细胞及B淋巴细胞中增殖,引起机体体液免疫及细胞免疫反应能力的下降。调节免疫的各种细胞因子在感染PCV-2后也有一定程度的改变,PCV-2感染可引起IL-10分泌的增加,PCV-2与猪天然干扰素分泌细胞相互作用,可使这些细胞分泌干扰素的能力下降。PCV-2造成免疫抑制也与病毒ORF3分泌的功能蛋白有一定的关系,ORF3可诱导免疫细胞凋亡,主要是激活caspase-8途径而不是caspase-9途径。

抗菌肽的作用机制与应用前景

各种感染性疾病日益严重地威胁着人类的健康,虽然新的抗生素不断被发现,但是随之而来的细菌耐药性也日益增强,新型抗感染药物的开发日趋显得重要。抗菌肽是在诱导条件下,由动植物产生的一类分子质量在4 ku左右的免疫多肽。它具有较小的分子质量,良好的耐热性和较小的抗原性,且具有广泛的抗菌活性。某些抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌及抑制癌细胞生长的作用。因此,抗菌肽有望发展成为一种新型抗菌药和抗肿瘤药物,对人类健康将产生深远的影响。