HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力

目的:建立弱酸处理后细胞表面HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力,并评估其实用性。方法:采用不同pH的柠檬酸缓冲液处理高表达HLA-B*1301的C1R细胞不同时间,中和pH后用含β2m蛋白、布雷非德菌素A的培养液重悬细胞,加入多肽(多肽组)或不加多肽(空白对照)37℃孵育,加入抗HLA抗体后采用流式细胞术检测,以多肽组与空白对照组荧光强度的比值作为衡量HLA分子重构水平强弱的指标,进而代表多肽与HLA-B*1301分子的结合力。结果:pH3.0的缓冲液处理1 min的条件下,HLA-多肽复合物变性解离,细胞表面只保留HLA重链分子,添加具有结合力的多肽可显著提升HLA分子重构水平,可以此评价多肽与HLA-B*1301的结合力。结论:HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力操作简便,结果可靠,也可为研究其他低频HLA分子抗原递呈模式提供参考。

三氯乙醇和三氯乙酸在诱发三氯乙烯药疹样皮炎中的作用

[背景]三氯乙烯职业暴露是导致药疹样皮炎发病的主要原因,然而其代谢产物是否参与疾病的发生尚不明确。[目的]检测三氯乙烯的代谢产物三氯乙酸和三氯乙醇的致敏性,进一步探讨二者在诱发三氯乙烯药疹样皮炎(TIHD)中的作用。[方法]体外细胞研究通过培养人髓系白血病单核细胞株(THP-1),设置三氯乙酸和三氯乙醇染毒浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol·L^(-1),采用ELISA法检测上清中白细胞介素-8(IL-8)的表达水平;采用Western blotting法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平。人群研究分别设置三氯乙烯非接触对照组(20人)、三氯乙烯接触对照组(20人)、TIHD入院病例组(10人)和TIHD出院病例组(7人),共57人,利用淋巴细胞分离液分离其外周血单个核细胞后,加入0.5、2.0 mmol·L^(-1)的三氯乙酸和三氯乙醇进行染毒处理,利用CCK-8法检测外周血单个核细胞存活率。[结果]体外细胞研究结果:随着染毒剂量增高,三氯乙酸和三氯乙醇对THP-1细胞毒性逐渐增加,并且THP-1细胞IL-8表达水平逐渐增高,表现出剂量依赖性(相关分析,均P<0.05);与未染毒组相比,在1.0、2.0、4.0 mmol·L^(-1)染毒剂量下,三氯乙酸染毒组IL-8水平分别增加了116.30%、176.08%、541.18%,三氯乙醇染毒组IL-8水平分别增加了176.08%、366.70%、670.48%(P<0.05);Western blotting检测结果显示,与空白对照组相比,1.0、2.0、4.0 mmol·L^(-1)三氯乙酸组iNOS的表达水平分别增加了93.73%、87.08%、238.06%(P<0.05),1.0、2.0、4.0 mmol·L^(-1)三氯乙醇组iNOS的表达水平分别增加了95.99%、486.29%、735.72%(P<0.05)。人群研究结果显示:与非接触对照组相比,出院病例组外周血单个核细胞经0.5、2.0 mmol·L^(-1)三氯乙酸处理后细胞存活率分别增加了5.81%、5.64%(P<0.05);而在该组人群三氯乙醇处理后的细胞存活率变化未见统计学意义(P>0.05);同样,三氯乙烯接触对照组、入院病例组的外周血单个核细胞经三氯乙酸和三氯乙醇处理后,其细胞存活率差异也均无统计学意义(P>0.05);结果提示出院病例组人群外周血中存在三氯乙酸抗原特异性淋巴细胞。[结论]三氯乙酸和三氯乙醇均具有体外细胞致敏性,三氯乙酸可能作为致敏原参与了TIHD的发生过程。

MBP、MEHP诱导小鼠睾丸间质细胞自噬过程中PTEN的相关研究

[目的]目前对于邻苯二甲酸酯的研究多集中于其原型,但有学者认为,邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二乙基己基酯的毒性作用可能是其在体内的代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸单乙基己酯(MEHP)所致。本研究拟探讨MBP和MEHP对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)自噬的影响以及与第10号染色体缺失的同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的相关研究。[方法]体外培养TM-3并取其对数生长期,预实验设置毒物浓度梯度为0(对照组)、50、100、200、400、800μmol/L,染毒24 h后,利用改良寇氏法计算MBP、MEHP的半数致死浓度(IC50)后,确定实验染毒浓度为0(对照组)、200、400、800μmol/L。分别采取CCK-8法检测不同毒物剂量和不同染毒时间对细胞存活率的影响;透射电镜观察400μmol/L的MBP、MEHP诱导24 h后具有双层膜状结构的自噬小体;单丹黄酰尸胺(MDC)免疫荧光法检测细胞自噬囊泡的荧光信号强度;采用Western blot技术检测自噬标志蛋白LC3、p62和自噬调节相关蛋白PTEN的表达水平。[结果] CCK-8结果显示:与对照组相比,随着MBP、MEHP染毒剂量增高,细胞存活率降低(P<0.05)。透射电镜结果显示:400μmol/L MBP、MEHP染毒24 h后细胞内可见具有双层膜状结构的自噬小体。MDC法检测结果显示:与对照组相比,200μmol/L MBP、MEHP染毒组荧光信号强度差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP染毒组荧光信号强度分别增加了9.0、16.8倍;400、800μmol/L MEHP染毒组荧光信号强度增加了16.3、26.4倍,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示:200μmol MBP、MEHP染毒组LC3II/LC3I、PTEN表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP染毒组LC3II/LC3I蛋白表达水平分别增加了7.5、13.6倍,PTEN表达水平增加了4.8、15.4倍;400、800μmol/L MEHP染毒组LC3II/LC3I蛋白表达水平增加了4.5、9.8倍,PTEN表达水平增加了5.7、14.4倍(P<0.05);200μmol/L MBP染毒组p62表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),400、800μmol/LMBP染毒组p62蛋白表达水平分别降低了43%、72%;200、400、800μmol/L MEHP染毒组p62蛋白表达水平也分别降低了55%、80%、88%(P<0.01)。[结论]一定剂量的MBP、MEHP可提高TM-3细胞自噬水平,并且PTEN表达水平与细胞自噬水平呈正相关趋势。

邻苯二甲酸单丁酯和邻苯二甲酸单乙基己酯联合染毒对小鼠睾丸间质细胞自噬水平的交互作用

目的探讨邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸单乙基己酯(MEHP)染毒对小鼠睾丸间质细胞的自噬的影响以及MBP+MEHP联合染毒的交互作用分析。方法将处于对数生长期的TM-3细胞分别暴露于0(对照)和400μmol/L的MBP、MEHP及400μmol/L MBP+400μmol/L MEHP溶液中;染毒24、36、48 h后,采取CCK-8法检测细胞的存活率;染毒24 h后,采用单丹黄酰尸胺(MDC)免疫荧光法检测细胞自噬囊泡的荧光信号强度;染毒24 h后,采用Western blot法检测自噬标志蛋白LC3和p62的表达水平。结果与对照组相比,MBP和(或)MEHP染毒TM-3细胞的存活率均下降,自噬囊泡的荧光信号强度均增高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高,p62蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。MBP和MEHP联合染毒对TM-3细胞的存活率、自噬囊泡的荧光信号强度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白表达水平具有交互作用,具体均表现为拮抗作用(P<0.01)。结论MBP和(或)MEHP体外染毒均可诱导TM-3细胞自噬水平升高,MBP和MEHP联合染毒交互作用表现为拮抗作用。

MBP和MEHP联合染毒致小鼠睾丸间质细胞的凋亡作用及其可能机制

[目的]探讨邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸单乙基己酯(MEHP)染毒致小鼠睾丸间质细胞的凋亡作用及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子4(ATF4)与C/EBP同源蛋白(CHOP)参与的可能机制。[方法]培养小鼠睾丸间质细胞(TM-3细胞)并且测出细胞生长曲线;用CCK-8法检测细胞在染毒浓度400μmol/L状况下的细胞活性变化;用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;应用免疫印迹法检测GRP78、ATF4和CHOP含量的变化。单因素方差分析法分析染毒组与对照组之间的关系,2×2析因设计法判断联合染毒的交互作用,当(|MBP+MEHP组指标-对照组指标)|<(|MBP组指标-对照组指标)|+(|MEHP组指标-对照组指标)|,可判定交互作用类型为拮抗作用。[结果]细胞在24～60 h时间段内处于对数生长期,且细胞正常状态下的凋亡数量比较稳定。细胞活性检测结果显示MEHP染毒对细胞的抑制率比MBP的大,并且MBP+MEHP联合染毒且具有交互作用,其作用方式为拮抗作用[24 h:(|53.21±7.68)%|<(|42.99±8.23)%|+(|65.46±8.29)%)|;36 h:(|79.87±3.76)%|<(|53.12±4.33)%|+(|74.80±4.96)%|;48 h:(|85.97±6.07)%|<(|38.98±9.59)%|+(|80.73±4.99)%|],具有统计学意义(P <0.05);细胞凋亡比例也呈现出MEHP组[早期凋亡:(17.44±0.82)%,总凋亡:(44.24±0.89)%]大于MBP染毒组[早期凋亡:(14.58±0.97)%,总凋亡:(29.46±0.58)%],同时出现MEHP+MBP联合染毒组[早期凋亡:(8.58±0.35)%,总凋亡:(32.28±0.41)%]的凋亡比例小于各单独染毒组之和,呈现出拮抗作用;ATF4和GRP78在MEHP染毒组的表达量高于MBP染毒组,MEHP+MBP联合染毒组表达量低于MEHP染毒组但高于MBP染毒组,并且表现出拮抗作用。CHOP的表达量与对照组相比也有变化,MEHP染毒组表达量较MBP染毒组表达量高,在MEHP+MBP联合染毒组表达量低于单独染毒组,并且表现出拮抗作用,但MBP染毒组没有主效应。[结论] MBP、MEHP染毒致TM-3细胞凋亡具有主效应,MBP和MEHP联合染毒致TM-3细胞凋亡具有交互作用,呈现拮抗作用。GRP78-ATF4-CHOP通路可能参与MBP、MEHP染毒致TM-3细胞的凋亡过程。

CHOP通路在邻苯二甲酸单丁酯和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯联合暴露致小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的探讨邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒致体外培养的小鼠睾丸间质细胞(TM-3)凋亡过程中CHOP通路的作用。方法将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于0(对照)、50、100、200、400、800μmol/L的MBP和(或)MEHP溶液24、36、48 h后,采用CCK-8法测定细胞活性。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)、MBP(400μmol/L)、MEHP(400μmol/L)和MEHP(400μmol/L)+MBP(400μmol/L)溶液24 h后,电镜下观察小鼠睾丸间质细胞内质网超微结构的变化。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)及200、400、800μmol/L MBP和(或)MEHP溶液24 h,流式细胞术检测细胞早期凋亡情况,免疫印迹法检测内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CHOP的表达水平。结果与对照组相比,各浓度MBP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异有统计学意义(P<0.05);且随着MBP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MBP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除100μmol/L组呈上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P<0.05);且随着MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率在50μmol/L组呈上升趋势,在100μmol/L组呈先下降后上升的趋势,在400μmol/L组呈下降趋势,200μmol/L和800μmol/L组抑制率呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP+MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P<0.05);且随着MBP+MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈现上升趋势。随着MBP+MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除200、400μmol/L组呈现逐渐上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP和(MEHP)染毒组TM-3细胞的早期凋亡细胞比例均较高,差异有统计学意义(P<0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞的早期凋亡细胞比例均呈现上升趋势。在同一染毒浓度下,睾丸间质细胞早期凋亡比例依次为MBP+MEHP<MBP<MEHP,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各浓度MBP和(或)MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均增加,差异有统计学意义(P<0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP和(或)MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均呈逐渐上升的趋势。结论 MBP和(或)MEHP染毒可致内质网损伤,上调GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达,这可能是MBP和(或)MEHP引起小鼠睾丸间质细胞凋亡的重要途径。