保和丸对溃疡性结肠炎小鼠肠道内A.muciniphila菌的调节作用

目的 采用实时荧光定量PCR技术检测保和丸对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道内Akkermansia muciniphila菌属的调节作用。方法 适应性喂养1周后,将小鼠随机分为正常组,模型组,5-氨基水杨酸组,保和丸组。除正常组外,其他组小鼠均以3%葡聚糖硫酸钠溶液灌胃7 d,制备小鼠溃疡性结肠炎模型,造模成功后连续7 d给予药物治疗,收集粪便样本,提取粪便总DNA,用荧光定量PCR方法检测并计算其拷贝数以反映各组A.muciniphila菌变化。结果 与正常组比较,保和丸组的A.muciniphila菌拷贝数显著升高,模型组拷贝数较之约升高1倍,5-氨基水杨酸组拷贝数略有降低。结论 保和丸明显升高溃疡性结肠炎小鼠肠道中A.muciniphila菌含量,A.muciniphila菌在模型组小鼠肠道中有一定增殖情况,5-氨基水杨酸对A.muciniphila菌基本无作用,或许会抑制其增殖。

葛根芩连汤对抗生素相关性腹泻大鼠模型肠系膜淋巴结IRF4与XBP-1的影响

目的:探究葛根芩连汤对抗生素相关性腹泻(AAD)大鼠模型肠系膜淋巴结干扰素调节因子4(IRF4)与X-盒结合蛋白1(XBP-1)的影响。方法:SD大鼠180只,随机取150只用于制备AAD模型,给予克林霉素(250 mg/kg)灌胃,1次/d,持续给药7 d,剩余30只作为正常组并灌胃等体积生理盐水。造模成功后随机分为5组,即模型组、葛根芩连汤高(GQD-H组,10.08 g/kg)、中(GQD-M组,5.04 g/kg)、低剂量组(GQD-L组,2.52 g/kg)和双歧杆菌活性菌胶囊组(双歧菌组,0.15 g/kg),每组30只。以上6组大鼠分别在灌胃后3 d、7 d、14 d每组随机取10只于麻醉后处死,提取结肠组织,分别采用HE染色法及免疫组化方法观察结肠组织形态及IRF4与XBP-1蛋白表达量变化,无菌条件下采集大鼠肠系膜淋巴结,提取淋巴结总RNA后经过反转录PCR合成cDNA,随后采用qPCR技术检测3 d、7 d、14 d不同持续给药时间段内葛根芩连汤对大鼠AAD模型中淋巴结IRF4与XBP-1 mRNA的表达水平。结果:3个时间段的检测结果均显示模型组结肠组织明显损伤,炎性细胞浸润,且IRF4与XBP-1 mRNA表达水平较正常组均显著上调(P<0.05),与模型组比较,葛根芩连汤高、中、低剂量组以及双歧杆菌活性菌胶囊组结肠组织均有不同程度恢复,且IRF4与XBP-1 mRNA表达水平较正常组均显著下调(P<0.05)。结论:葛根芩连汤可以降低因服用克林霉素导致的AAD引起的肠系膜淋巴结IRF4与XBP-1 mRNA高表达及结肠组织损伤,调节肠道炎症。

基于肠道微生物—免疫途径探讨葛根芩连汤治疗肠道免疫疾病的研究现状

成年人肠道微生物占自身微生物的90%,肠道也是人体最大的免疫器官,掌管着人体70%的免疫力,目前,肠道微生物—免疫途径已成为治疗肠道免疫疾病的热点。本文基于以上两个途径综述了葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎、抗生素相关性腹泻、肠道易激综合征、放射性直肠炎作用机制,以冀为葛根芩连汤治疗肠道疾病提供更多理论依据。

基于网络药理学和分子对接探讨黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制

目的 通过网络药理学和分子对接探讨黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制。方法 首先,根据口服生物利用度和类药性为筛选条件,在TCMSP数据库获取黄连解毒汤的活性成分及对应靶点,运用Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测,合并两个数据库所获得的靶点信息,通过UniProt数据库查找对应基因名;其次,在GeneCards、TTD、DrugBank三大数据库中以“type 2 diabetes mellitus”为关键词进行检索,得到疾病靶点;取黄连解毒汤和2型糖尿病的交集靶点、黄连解毒汤的有效成分,利用Cytoscape 3.7.2软件构建成分-靶点网络,并借助STRING数据库对交集靶点进行蛋白相互作用网络分析;然后使用David数据库对交集靶点进行GO富集及KEGG富集分析,最后进行分子对接验证。结果 黄连解毒汤有84个有效成分及859个靶点,疾病靶点1 181个,得到310个防治2型糖尿病的潜在作用靶点,72个活性成分,排名前3的有效成分依次为槲皮素、黄芩苷、巴马汀。通过KEGG富集分析筛选出糖尿病并发症中的AGE/RAGE信号通路,分子对接结果显示槲皮素、黄芩苷、巴马汀与核心蛋白受体RAGE对接良好。结论 黄连解毒汤可能通过槲皮素、黄芩苷、巴马汀等关键成分调控AGE/RAGE信号通路,从而发挥治疗2型糖尿病的作用。

皂角刺总黄酮对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭能力影响的实验研究

目的:研究皂角刺总黄酮对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,探讨其抗肿瘤作用机制.方法:通过体外培养人肝癌HepG2细胞,用不同浓度的皂角刺总黄酮处理后,采用WST-1法检测皂角刺总黄酮对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用,琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化,流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞的凋亡率,划痕实验和Transwell小室检测皂角刺总黄酮对HepG2细胞侵袭、转移的影响.结果:不同浓度的皂角刺总黄酮作用于细胞48 h后,能显著抑制HepG2细胞的增殖,随着药物浓度的增加,抑制作用增强,IC50为(190.62±0.89)mg/L;流式AnnexinV/PI双染法检测显示,不同浓度的皂角刺总黄酮均可诱导HepG2细胞凋亡;不同浓度的皂角刺总黄酮处理组发现凋亡细胞所特有的DNA ladder条带;皂角刺总黄酮可降低HepG2细胞的黏附能力,使Tr-answell小室膜上的肝癌细胞明显减少,并且呈剂量依赖性.结论:皂角刺总黄酮能明显抑制肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭能力和诱导其凋亡.

大熊猫等八种野生珍稀动物蛔虫ITS-2基因的序列分析

为了探讨寄生在大熊猫、小熊猫、黑猩猩、白眉长臂猿和4种熊科动物(北极熊、棕熊西藏亚种、狗熊四川亚种和棕熊东北亚种)体内蛔虫的分类地位,测定了核糖体第二内转录间隔区(ITS-2)基因序列,并对这些序列进行同源性分析和采用UPGMA法构建分子系统树。结果表明:寄生在大熊猫、小熊猫和4种熊科动物体内的蛔虫均为贝蛔属蛔虫;寄生在黑猩猩和白眉长臂猿体内的蛔虫为蛔属蛔虫。分析结果提示蛔虫与宿主之间存在协同进化关系。

基于非靶向液-质联用探究杜仲啤酒的有效成分

自啤酒进入我国后,其市场份额呈现爆发式增长,在促进经济增长的同时,也被大多数人接受和喜爱。然而,随着生活节奏日益加快和工作压力持续增长,人们的饮酒率持续上涨,由于过度饮酒导致的消化道疾病、心血管疾病等也日益增加,因此可利用一些具有保健功能的药材,研发出保健型啤酒以替代普通啤酒。中药杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效,临床多用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等症状。本研究结合中药杜仲的优势和啤酒的特点,利用杜仲研制出保健型啤酒,再利非靶向液-质(LC-MC)联用对杜仲啤酒进行成分鉴定与分析,以期为杜仲啤酒的开发提供一定的实验依据。

基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响

目的:基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响。方法:从36只SD大鼠中随机选取6只作为对照组,其余大鼠给予高脂饲料联合1%链脲佐菌素(30 mg·kg^(-1))建立糖尿病模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄连解毒汤高剂量组(6.25 g·kg^(-1))、黄连解毒汤中剂量组(3.13 g·kg^(-1))、黄连解毒汤低剂量组(1.56 g·kg^(-1))及二甲双胍组(100 mg·kg^(-1)),每组各6只。各药物组按照相应剂量灌胃给药,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续21 d。第7天、第14天及第21天灌胃后,收集大鼠粪便,提取肠道菌群DNA。利用ERIC-PCR技术和Sanger测序检测大鼠肠道菌群结构与DNA同源性。结果:灌胃第7天,对照组条带较多集中在100~750 bp;与对照组比较,模型组条带在1 000~2 000 bp的亮度增强,在300~750 bp的亮度减弱;与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在750 bp的亮度增强。灌胃第14天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在1 000 bp以上的亮度减弱。灌胃第21天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在300~750 bp的亮度增强。DNA测序结果显示,灌胃第21天,对照组500 bp条带的优势菌群为拟杆菌属、杜氏邓氏菌和金黄杆菌属;模型组400 bp和1 000 bp条带的优势菌群为梭菌目细菌、普拉梭菌、铜绿假单胞菌和杆菌属。灌胃第7天,黄连解毒汤高剂量组750 bp条带的优势菌群为布劳特菌和拟杆菌属;黄连解毒汤中剂量组200 bp条带的优势菌群为脆弱拟杆菌和拟杆菌属;黄连解毒汤低剂量组1 200 bp条带的优势菌群为双发酵副梭菌;二甲双胍组1 000 bp条带的优势菌群为大肠埃希杆菌。灌胃第14天,黄连解毒汤高剂量组700 bp条带的优势菌群为拟杆菌目细菌和假单胞菌;黄连解毒汤中剂量组550 bp条带的优势菌群为假锁杆菌属和链霉菌属;黄连解毒汤低剂量组350 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、杜氏邓氏菌和杆菌科细菌;二甲双胍组290 bp条带的优势菌群为弗格森埃希菌和大肠埃希杆菌。灌胃第21天,黄连解毒汤高剂量组1 000 bp条带的优势菌群为普雷沃氏菌属;黄连解毒汤中剂量组600 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、杜氏邓氏菌和拟杆菌属;二甲双胍组400 bp条带的优势菌属为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、普雷沃氏菌属、杆菌科细菌和杆菌属。结论:黄连解毒汤对T2DM大鼠的肠道菌群结构具有调节作用,菌群调节效果受药物剂量和治疗时间的影响。

斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病

[目的]探讨斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病的可行性,为制备诊断猪蛔虫病试剂盒提供参考依据。[方法]采用猪蛔虫的重组蛋白AS16抗原和胶体金标记葡萄球菌蛋白A(SPA),根据免疫渗滤原理,建立抗猪蛔虫抗体的斑点金免疫渗滤检测法。[结果]斑点免疫金渗滤法检测1200份猪血清样本中猪蛔虫抗体,检出阳性率为25.00%,而琼脂扩散试验(AGP)阳性检出率为15.00%。[结论]斑点金免疫渗滤检测法具有操作简便,灵敏度高,特异性强的优点,可用于猪蛔虫病的快速检测。

金黄色葡萄球菌感染野兔的诊治

为了探讨野兔死亡原因,试验无菌采取病死野兔的心脏、肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等组织病料进行细菌的分离培养、生化和PCR鉴定,并根据临床症状、剖检变化以及实验室检验进行诊断。结果表明:野兔发病为葡萄球菌感染所致。

应用间接ELISA检测猪旋毛虫抗体

以猪旋毛虫抗原基因Ts88的重组蛋白为包被抗原,建立了猪旋毛虫抗体间接ELISA检测方法。最佳抗原包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释倍数为1:80。采用间接ELISA方法检测2000份猪血清,阳性检出率为1.5%,血清样本对应猪肉采用镜检法,阳性检出率为1.30%。试验结果显示,该方法操作简便、快速、特异性好,适用于猪旋毛虫的临床诊断和流行病学调查。

贵州山羊痘的病原学研究与血清学检测

2002年10月以来,贵州省8个养羊场相继发生一种以皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹的传染病。通过电镜观察在痘疹材料中发现大量典型的痘病毒粒子;感染鸡胚后绒毛尿囊膜增厚、充血和出现痘斑;接种BHK21单层细胞引起明显的细胞病变效应,而且这种现象能够被山羊痘参考血清所抑制。血清学检测结果表明,患病羊痘疹材料中山羊痘抗原的阳性率为66 7%;血清样本中山羊痘抗体的阳性率为47 4%。根据对本次疫病的病原学研究和血清学检测,可以确诊贵州省山羊痘暴发流行。

应用间接血凝试验(IHA)诊断猪蛔虫病

以猪蛔虫抗原致敏绵羊红细胞制备检测猪蛔虫特异性抗体的间接血凝诊断试剂,与猪蛔虫抗体发生特异性凝集反应。结果表明,用间接血凝诊断试剂对3 000份猪血清进行现场检测,阳性率为30.00%;而琼脂扩散试验(AGP)的阳性率为13.00%,表明,间接血凝试验(IHA)比GAP敏感,间接血凝诊断试剂可用于猪蛔虫病的快速诊断。

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)基因的克隆及序列分析

为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础,试验以竹叶青蛇毒毒腺的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增L-氨基酸氧化酶(LAAO)基因,经克隆和测序并通过Blast分析。结果表明:LAAO基因与GenBank中公布序列编码的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因的序列(AY277739)同源性达98.23%。

肠侵袭性大肠杆菌感染野猪的诊断和药敏试验

无菌取病死野猪的心脏、肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等组织病料,进行细菌的分离培养与PCR鉴定,分离出肠侵袭性大肠杆菌。结合临床症状、剖检病变和实验室诊断,从而确诊野猪病死于肠侵袭性大肠杆菌感染。并对分离菌株进行药敏试验,为野猪的肠侵袭性大肠杆菌感染疾病的诊断和防治提供参考。

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的表达载体的构建及重组蛋白抗肿瘤的研究

将经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物进行连接,将产物Pet28a(+)-LAAO表达载体转化BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经Western-blot分析表明,重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别.将鼻咽癌CNE-2Z、人宫颈癌LYA01021和卵巢癌A2780MSC细胞悬液接种小鼠建立小鼠实体瘤模型,分别用不同浓度重组蛋白接种荷瘤小鼠,根据瘤重和小鼠存活时间计算抑瘤率和对荷瘤小鼠生命延长率.结果表明:重组蛋白对低、中和高剂量组荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率与阴性对照组均存在极显著差异(P<0.01).本研究为开发利用竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶提供依据,为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础.

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件:最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。

贵州野生天麻抗真菌肽基因表达载体的构建

为了构建凤冈野生天麻的抗真菌肽基因(gaf)的表达载体,经BamHI和HindIII酶切的pMD18-T-gaf和pET32a(+)质粒的纯化回收产物并进行连接,连接产物pET32a(+)-gaf转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,采用菌落PCR、酶切鉴定和阳性质粒测序分析。结果表明:构建的凤冈野生天麻抗真菌肽基因表达载体通过菌落PCR、酶切鉴定和阳性质粒测序分析,目的片段成功插入载体,目的片段与预期的gaf基因大小(545 bp)相符。试验成功构建了贵州野生天麻抗真菌肽基因表达载体,pET32a(+)-gaf可以用来制备抗真菌蛋白。

凤冈野生天麻抗真菌肽基因(gaf)的克隆与序列分析

为了克隆凤冈野生天麻的抗真菌肽基因(gaf),以凤冈野生天麻的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增抗真菌肽基因(gaf),经克隆和测序结果显示:RT-PCR产物电泳扩增的目标条带长度为545 bp;经测序和序列分析,该基因与Genebank中公布的序列编码天麻抗真菌蛋白的基因序列(AY032588)同源性达97%。此研究成功地克隆了凤冈野生天麻抗真菌肽编码基因。

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pCANTAB5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.