葡萄糖饥饿促进hnRNPA2B1细胞质转位并激活AKT维持前列腺癌细胞存活

目的探讨葡萄糖饥饿后介导核不均一核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2B1)向细胞质转位的分子机制及hnRNPA2B1细胞质转位增加对前列腺癌PC3细胞存活的影响。方法前列腺癌PC3细胞株在含葡萄糖的正常1640培养基中常规培养(正常组),在不含葡萄糖的1640培养基中培养构建葡萄糖饥饿模型(饥饿组)。2组分别进行不同处理:去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)联合尼克酰胺(nicotinamide,NAM)处理(TSA/NAM组)、AKT抑制剂BEZ235处理、si-NC转染和si-hnRNPA2B1转染。采用细胞质和细胞核蛋白分离技术、免疫沉淀联合Western blot实验检测hnRNPA2B1乙酰化(acetylation,Ac)水平、AKT总蛋白及其磷酸化水平、细胞质和细胞核中hnRNPA2B1的表达水平;采用CCK-8检测各组细胞存活情况。结果与正常组比较,在葡萄糖饥饿处理3~5 h后,PC3细胞hnRNPA2B1蛋白乙酰化降低(P<0.01),其细胞质转位增加(P<0.01),AKT磷酸化增强促进AKT信号通路的激活;与饥饿组比较,使用TSA/NAM、BEZ235和转染si-hnRNPA2B1处理后hnRNPA2B1乙酰化水平明显上调(P<0.01),能够抑制葡萄糖饥饿介导的hnRNPA2B1细胞质转位、抑制AKT磷酸化,同时导致葡萄糖饥饿处理后的细胞存活率进一步降低(P<0.01)。结论葡萄糖饥饿环境通过诱导Ac-hnRNPA2B1-AKT信号通路激活,从而维持PC3细胞存活。

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的 :获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体 (anti Id)。方法 :分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA ,经RT PCR分别扩增抗体VH和VLDNA ,进而连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后 ,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现anti IdScFv的噬菌体单克隆。结果 :VH、VL和ScFvDNA分别约为 34 0、32 0和 75 0bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后 ,在随机筛检的 5 0个克隆中得到 15个呈现anti IdScFv的噬菌体单克隆。结论 :用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti IdScFv,从而为进行结肠癌重组anti

重组人BAFF_(112-285)的制备及活性分析

目的 制备具有功能活性的重组人TNF家族的B细胞激活因子 (BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfa mily ,BAFF)胞外区 1 1 2～ 2 85氨基酸残基段 (rhBAFF1 1 2 -2 85) ,为BAFF的深入研究奠定基础。方法 提取人HL 6 0细胞总RNA ,经RT PCR扩增编码人BAFF胞外区 1 1 2～ 2 85氨基酸残基 (BAFF1 1 2 -2 85)的cDNA ,行序列测定后 ,构建于原核表达载体pQE 80L并转化大肠杆菌DH5α ,经IPTG诱导表达rhBAFF1 1 2 -2 85,Ni2 + NTA层析纯化 ,进而经3 H TdR掺入实验检测其免疫学活性。结果 RT PCR扩增得到了 5 2 5bp的DNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF1 1 2 -2 85的cDNA序列一致 ,该胞外区片段在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达水平达细菌总蛋白的 4 5 .7% ,经纯化后纯度可达 98.4 % ,活性检测证实其能明显刺激外周血淋巴细胞活化。结论 利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF1 1 2 -2 85,所获纯化产物具有生物学活性 。

胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型ScFv的制备

目的制备胃癌单抗 MGd1的单链可变区片段 (single chain variable fragm ent,Sc Fv) ,为胃癌体内诊疗研究提供候选靶向载体分子。方法从 MGd1杂交瘤分离 m RNA,RT- PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因 (VH和 VL DNA) ,二者经 linker DNA连接形成 Sc Fv DNA。将 Sc Fv DNA与载体 p CANTAB5 E的连接产物转化于大肠杆菌 TG1,经 M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体 Sc Fv。以高表达 MGd1结合抗原的细胞株 KATO 对重组噬菌体抗体 Sc Fv进行两轮筛选后 ,随机挑取克隆经 EL ISA筛选 MGd1Sc Fv单克隆 ,并对其结合抗原的能力进行鉴定。结果 VH、VL 和 Sc Fv DNA分别约为 340、32 0和 75 0 bp。经两轮亲和筛选后 ,在随机筛检的 30个克隆中得到 12个噬菌体呈现型 MGd1Sc Fv单克隆 ,其中结合抗原能力强的克隆有 5个。结论用噬菌体呈现技术成功地获得了单抗 MGd1的 Sc Fv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。

噬菌体呈现技术制备结肠癌抗独特型抗体

以纯化的鼠抗人结肠癌细胞单克隆抗体 (简称单抗 )MC5与钥孔血蓝素 (KLH)的交联物经腹腔免疫Balb c小鼠 ,取脾分离mRNA .RT PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因片段 (VH 和VLcD NA ,大小分别约为 340bp和 32 0bp) ,二者经linkerDNA连接形成ScFv(singlechainvariablefragment)DNA(约 75 0bp) .将ScFvDNA与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体ScFv文库 .以单抗MC5对ScFv文库进行 4轮亲和筛选后 ,随机挑取 80个克隆经酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选出 2 2个呈现ScFv形式抗独特型抗体(抗 IdScFv)的噬菌体单克隆 .竞争抑制实验表明 ,在 2 2个阳性克隆中有 4个克隆所呈现的抗 IdScFv属β或γ型 .针对单抗MC5的噬菌体呈现型抗 IdScFv的制备 ,为筛选新的结肠癌重组抗

Bcl-2表达受抑可增加单核白血病细胞系对TNFα的敏感性

目的 探讨Bcl 2反义基因在单核白血病细胞系U937细胞中的作用 ,以期丰富Bcl 2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。方法 将反义Bcl 2基因转染于U937细胞 ,建立U937/as bcl2细胞模型 ,经流式细胞技术检测模型细胞Bcl 2的的表达水平 ,通过细胞计数观察模型细胞在正常培养条件下和有重组人肿瘤坏死因子α (rhTNFα)存在时的生长和存活特性变化。结果 ①U937/as bcl2模型细胞的Bcl 2蛋白表达水平明显下降 ,但其在正常培养条件下的生长和存活能力无明显变化。②在rhTNFα的作用下 ,模型细胞的存活率较对照细胞者明显下降。结论 ①单独反义bcl 2基因转染可明显抑制U937细胞Bcl 2的表达 ,但对细胞在正常培养条件下的生长和存活能力无明显影响。②反义Bcl

反义bcl-2寡脱氧核苷酸对U937细胞增殖和存活能力的影响

本实验观察了与人类ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ翻译起始部位相互补的硫代反义ｂｃｌ－２寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ｓＯＤＮ）对Ｕ９３７细胞增殖和存活能力的影响，结果表明：一定浓度的ＡＳ－ｓＯＤＮ可明显抑制细胞Ｂｃｌ－２蛋白的表达，但对细胞增殖和存活能力无明显影响。

反义bcl-2基因转染对单核白血病细胞存活及化疗耐受能力的影响

目的 :探讨bcl 2反义核酸在单核白血病细胞系U937细胞中的作用 ,以丰富bcl 2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料。方法 :将反义bcl 2基因表达载体 pLXSN/as bcl 2转染于U937细胞 ,建立U937/as bcl 2细胞模型 ,利用流式细胞技术检测模型细胞bcl 2的表达水平 ;通过细胞计数观察模型细胞在正常培养条件下和有化疗药物Ara C或三尖杉酯碱存在时的生长和存活特性变化。结果 :①模型细胞的bcl 2蛋白表达水平明显下降。②模型细胞在正常培养条件下的生长和存活表型无明显改变。③在Ara C或三尖杉酯碱存在的情况下 ,模型细胞的存活率较对照细胞者明显下降。结论 :①单独反义bcl 2基因转染可明显抑制U937细胞bcl 2的表达 ,但对细胞在正常条件下的生长和存活表型无明显影响。②反义bcl 2基因转染可增加U937细胞对化疗药物的敏感性。

bcl-2对IL-1和TNFα表达的调节作用初探

通过将反义ｂｃｌ２ 基因转染于Ｕ９３７ 细胞， 建立了Ｂｃｌ２ 蛋白表达受抑的Ｕ９３７ 细胞模型， 证实了模型细胞的增殖和存活表型无明显变化． 放线菌素Ｄ结晶紫试验和ＥＬＩＳＡ检测表明模型细胞上清中ＴＮＦα的活性和含量无明显变化， 小鼠胸腺细胞增殖试验表明模型细胞上清中ＩＬ１ 活性升高， 提示ｂｃｌ２ 的表达对ＴＮＦα的表达无明显影响， 但可能在一定程度上抑制了ＩＬ１ 的表达或活性． 探讨ｂｃｌ２ 对细胞因子表达的调节作用，

人类bcl-2cDNA在NIH/3T3细胞中的表达

将０．９１ｋｂ的含有完整开放阅读框的人类ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ以正向克隆于逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲⅠ位点，经ＰＡ３１７细胞包装后感染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，筛选出Ｇ４１８抗性克隆，经免疫印迹证实人类ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ在ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中获得了表达。这一表达人类Ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型的建立为探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其它基因间关系的研究奠定了基础。

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的:MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段(ScFv)。方法:从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重、轻链可变区DNA(VH和VLDNA),两者经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv。以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果:VH、VL和ScFvDNA分别约为340bp、320bp和750bp。在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个。结论:用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。

程序性细胞死亡的哺乳类基因调控

程序性细胞死亡（ＰＣＤ）是一种与“坏死”不同的主动性“细胞自杀”过程。其调控机制重要而复杂，是一个由多基因参与的系统工程。其中ＰＣＤ的哺乳类基因调控是目前生命科学中的一个研究重点。本文简要综述了近年来发现的与ＰＣＤ调控相关的主要哺乳类基因的可能作用机制，并对其诱导或抑制ＰＣＤ的生物学意义进行了初步探讨。

基因治疗HIV感染策略的研究进展

本文简要介绍了当今基因治疗ＨＩＶ感染的基本策略，包括诱导性杀伤受染细胞，加强机体免疫力，干扰ＨＩＶ复制等。

硕士研究生分子生物学教学体会

搞好硕士研究生分子生物学教学是一项重要而艰巨的课题。认为 ,在硕士研究生分子生物学教学中 ,采取讲授教材与新进展专题讲座相结合、编写并使用提纲式分子生物学进展专题讲座教材来辅助教学、使用中英文“鸡尾酒”式授课方法、注重传授快速获取分子生物学新知识的技巧、保持分子生物学实验课的连续性、坚持闭卷问答式考试与撰写综述和实验设计相结合的成绩考核办法等策略 。

抗人结肠癌单抗MC5的功能性ScFv在大肠杆菌中的可溶性表达(英文)

目的 制备抗人结肠癌单抗MC5的具功能活性的可溶性单链可变区片段 (ScFv)。方法 从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA ,RT PCR分别扩增抗体质量、轻链可变区基因 (VH和VLDNA) ,经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,转化菌经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体。以高表达MC5结合抗原的人结肠癌细胞系SW4 80对重组噬菌体进行 2轮筛选后 ,经ELISA筛选呈现抗体ScFv片段的噬菌体单克隆。取 2个强阳性克隆的噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1,用于表达可溶性ScFv。经点印迹和Western印迹对可溶性ScFv进行鉴定 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。结果 所获得的VH、VL和ScFvDNA分别约为 340、32 0和 75 0bp。对重组噬菌体经 2轮亲和筛选后 ,经ELISA从 2 5个克隆中筛检出 10个抗原阳性克隆。源于 2个强阳性克隆的可溶性ScFv的分子质量为32 0 0 0u ,且浓集于细菌周质腔中 ,可溶性ScFv具有抗原结合活性 ,其结合位点与亲本单抗MC5相同。结论 针对MC5的具功能活性的可溶性ScFv的成功制备 ,为人结肠癌的体外 (乃至体内 )

噬菌体抗体库技术制备胃癌单抗MGd1的抗独特型抗体

目的获得胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型抗独特型抗体(抗-Id),为研制针对MGd1的抗-Id重组胃癌瘤苗创造条件。方法分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT-PCR分别扩增抗体VH和VLDNA,进而连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MGd1对文库进行4轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-IdScFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果VH、VL和ScFvDNA分别约为340、320和750bp。抗体ScFv文库经4轮筛选后,在随机筛检的40个克隆中得到17个呈现抗-IdScFv的噬菌体单克隆。在17个克隆中,有3个呈现β或γ型抗-IdScFv。结论应用噬菌体抗体库技术成功制备了针对单抗MGd1的抗-IdScFv,从而为筛选新的胃癌重组抗-Id瘤苗奠定了基础。

ICE样蛋白酶与细胞凋亡

细胞凋亡在维持多细胞有机体的正常发育、平衡机体内环境、抗御病毒入侵、预防细胞癌变等多方面都具有重要作用,ICE(IL-1βconverting enzyme)样蛋白酶因其与细胞凋亡的调控密切相关而越来越受到人们的广泛关注。本文仅就哺乳类ICE样蛋白酶与细胞凋亡的关系进行简要综述。

一DXFD_（52）相关人肝细胞cDNA的部分序列分析及其反转录病毒载体的构建

为了寻找和研究新的人类基因ｃＤＮＡ，本实验以Ｔ７ＤＮＡ聚合酶对—ＤＸＦＤ＿（５２）相关人肝细胞ｃＤＮＡ（ＤＥ）进行了分段部分测序，并将所测各部分序列分别在ＥＭＢＬ（欧洲分子生物学库）中进行核酸同源性检索，结果在库中没有找到任何具有同源性的人类基因或ＤＮＡ（或ｃＤＮＡ）片段。因此，我们初步认为ＤＥ为一新的人类基因ｃＤＮＡ片段。同时为初步探讨ＤＥ的功能，我们还成功地将ＤＥ构建于反转录病毒载体ｐＬＸＳＮ上。

人TNFα－EGF重组质粒的构建

本实验将编码人ＴＮＦａ分子上与其受体相关的部分核苷酸序列缺失，代之以人ＥＧＦ基因ｃＤＮＡ，实现基因重组。转化子经快速细胞破碎法初筛、经Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，从中挑选出２０个人ＴＮＦａ－ＥＧＦ阳性重组质粒，为进一步获得重组嵌合人ＴＮＦａ－ＥＧＦ分子和ＴＮＦａ作用机制的深入探讨奠定了初步基础。

朊蛋白病研究现状

朊蛋白 (PrionProtein ,PrP)病是一类进行性致死性神经变性疾病 ,其特征是细胞朊蛋白PrPc变构成致病性朊蛋白PrPsc ,其诊断方法包括组织病理学、电镜、生物试验及检测PrPsc等。致病因子PrPsc可通过多种途径进行传播 ,通过灭活PrPsc可以预防朊蛋白病 ,阻断PrPsc形成或加速其降解可能是治疗该类疾病的根本措施。