成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠。方法从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/+。结果成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠。结论成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠。

欧几里德几何距离矩阵法对FGFR2 Ser252Trp点突变小鼠头颅形状特征的分析

目的通过定量分析模拟Apert综合征患者的FGFR2 Ser252Trp突变小鼠模型和野生型小鼠头颅表型,并与Apert患者所表现出来的异常头颅颜面特征进行比较,探讨所建立的Apert小鼠模型能否真实地模拟Apert综合征患者的头颅表型。方法采用蚂蚁啃食的方法制备Ser252Trp突变小鼠和同窝对照小鼠头颅标本,用三维坐标测量仪检测头颅27个标记点的三维坐标值,用欧几里德几何距离矩阵法(euclidean distance matrix analysis,EDMA)对突变小鼠和对照小鼠头颅三维数据进行处理和统计分析。结果Ser252Trp突变小鼠头颅形状与同窝对照组相比具有统计学差异(P<0.01),突变小鼠头颅长度缩短,且头颅前端缩短比后部缩短更严重,头颅面部鼻骨长度、前颌骨、上颌骨及颧骨长度明显缩短(P<0.01),眼间距和额骨宽度变宽,颅腔长度有所缩短,宽度增加,颅顶升高(P<0.01),这与Apert患者颅面的临床表现高度相似:眼间距增宽,面中部发育不良,鼻骨缩短,上颌骨发育低下,突眼,颅腔变宽呈圆鼓状。结论FGFR2 Ser252Trp突变小鼠从表型上真实地反映Apert患者的头颅颜面特征,可以作为人类Apert综合征的较好模型用于有关疾病致病机制、手术及药物治疗的研究模型。

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。

骨形成蛋白4条件性RNA干扰小鼠的建立

为研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)在骨骼发育中的作用,我们以含有LoxPneo的pBSK/U6载体为骨架,构建小鼠BMP4条件性RNAi(conditional RNA interference),CRNA;载体(BMP4CRNAi),经KpnⅠ和AflⅢ双酶切获取针对bmp4并含neo基因的目的干扰片段,纯化后的目的片段显微注射入0.5d的FVB/NJ小鼠受精卵,并植入同期发情的假孕母鼠中,获取G0代转基因小鼠;利用PCR对G0代转基因小鼠基因型进行鉴定,PCR阳性的小鼠与FVB/NJ小鼠交配,最终获取稳定传代的BMP4CRNAi小鼠。稳定传代的BMP4CRNAi小鼠与成骨和软骨前体细胞表达Cre的转基因小鼠(Col2a1-Cre)交配,获取BMP4Col2a1-CRNAi小鼠。分离BMP4Col2a1-CRNAi小鼠原代软骨细胞,提取总RNA,利用半定量RT-PCR检测RNA干扰效率。小鼠基因型鉴定结果表明:成功获得条件性RNAi转基因小鼠;BMP4干扰效率检测结果表明:在软骨细胞中BMP4的干扰效率为81%。以上结果表明,我们成功制备了BMP4CRNAi小鼠和BMP4Col2a1-CRNAi小鼠,BMP4CRNAi小鼠与不同Cre转基因小鼠交配,可以研究BMP4在不同细胞、组织和器官的功能,BMP4Col2a1-CRNAi小鼠的获得为研究BMP4在软骨发育中的作用提供了合适的动物模型。

Apert综合征模型小鼠下颌骨形态特点的定量分析

目的比较分析FGFR2 Ser252Trp突变小鼠(mutant,Mu)下颌骨和同窝对照野生型小鼠(wild type,WT)下颌骨的形状和发育差异性。方法采用三维坐标测量仪检测下颌骨11个标记点的三维坐标值,用欧几里德几何距离矩阵法(euclidean distance matrix analysis,EDMA)对突变小鼠和对照小鼠下颌骨进行形状和发育分析。结果4周时FGFR2Ser252Trp突变小鼠下颌骨形状与同窝对照组相比整体有所缩小,但无统计学差异(P>0.05);8周时突变小鼠下颌骨形状缩小具有统计学差异(P<0.05),主要表现在冠状突和下颌角缩小并沿前后方向向前缩进,随着年龄的增加下颌角的缩进更明显。结论FGFR2 Ser252Trp点突变对小鼠下颌骨形状产生缩短畸形的影响,随着年龄的增加缩短影响有所加重。

原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景:传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降。如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键。目的:课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化。设计、时间及地点:细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。材料:C57BL/6品系新生小鼠9只。方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定。当细胞90%融合时以含5.5mg/L人转铁蛋白,3×10-8mol/L亚硒酸钠,10mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导。主要观察指标:诱导0,7d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,vonKossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定。结果:原代培养细胞24h贴壁,呈三角或多角形,培养4～6d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。诱导0d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7d明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结。与诱导0d时相比,诱导7d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多。结论:采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程。

成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究

目的本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化,为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。方法8周龄雄性C57小鼠和FGFR3功能持续增强的软骨发育不全(Ach)小鼠各6只,分为脂多糖(LPS)组和生理盐水对照组,每组3只。LPS15mg/kg或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧胫骨提取RNA,定量聚合酶链式反应(PCR)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、骨钙素(OC)的变化。LPS、碱性成纤维生长因子(bFGF)处理前成骨细胞系MC3T3E14小时后定量PCR检测IL-6、TNF-α、OC水平,成骨诱导7天后检测碱性磷酸酶(ALP)活性。结果LPS刺激后,骨组织和MC3T3E1的炎症递质基因IL-6、TNF-α的RNA水平显著增加(P<0.01),成骨标志性基因OC表达下调(P<0.05)。且Ach小鼠相应基因变化幅度显著高于C57的变化幅度(P<0.05)。MC3T3E1同时用LPS与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理组的IL-6、TNF-α、OC水平表达水平位于单独用LPS或bFGF组之间。成骨诱导7天后LPS处理组细胞ALP活性显著低于未处理组(P<0.05),bFGF处理组显著增高(P<0.01)。结论LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应,在细胞水平低剂量bFGF激活FGFR3减轻上述反应。

初中物理教学要结合学生的思想意志和心理倾向的培养

要使初中学生学好物理，掌握物理基础知识和基本方法，就必须培养学生养成良好的思想意志和心理倾向。有些学生物理成绩差，但其学习态度端正，主观也努力，智力也不错。成绩差的原因在于意志薄弱，信心不坚定，缺乏自觉性、主动性和自制性。为此．自己在近三十年的物理教学实践中得出以下几点看法，供同仁参考。

重组人甲状旁腺激素1-34促进小鼠间充质干细胞增殖及骨向分化

目的研究重组人甲状旁腺激素1-34[recombinant human parathyroid hormone1-34,rhPTH(1-34)]间断处理对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)增殖以及骨向分化的影响,进一步探讨rhPTH(1-34)促骨形成的机制。方法无菌条件下分离6～8周的C3H雄性小鼠BMSC,传代培养,10 nmol/L rhPTH(1-34)间断处理或者Vehicle处理,MTT检测细胞增殖;BMSC成骨诱导后,分别在3、6、9 d进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性测定;RT-PCR检测成骨细胞功能标志基因核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素蛋白(osteocalcin,OC)的表达水平;Western blot检测p-Erk1/2,p-P38信号通路。结果 rhPTH(1-34)间断处理促进BMSC增殖;诱导9 d时与对照组比较,显著增加ALP活性[D(405)/D(562):(0.625±0.049)vs(0.543±0.038),(P<0.05)];显著增加成骨功能相关基因Cbfα1(增加186.6%,P<0.01),OC(增加210.5%,P<0.01),OP mRNA(增加5.5%,P<0.05)的表达水平;p-Erk1/2,p-P38水平均增加。结论 rhPTH(1-34)间断处理通过激活下游的p-Erk1/2和p-P38通路,促进BMSC增殖,增强其向成骨细胞分化,使成骨细胞数量和活性增加,从而增加骨形成达到治疗骨质疏松的目的。

软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠的获得及其表型初步分析

目的获得在软骨细胞中条件性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠并进行初步表型分析。方法通过PTEN条件性基因敲除小鼠（Pten^flox/flox小鼠），与软骨细胞特异表达Cre重组酶的小鼠（Col2αCre）交配，获得在软骨细胞中特异敲除PTEN基因小鼠（Co12αCre：Pten^flox/flox）；同时，利用Pten^flox/flox小鼠与FGFR3增强型点突变小鼠（Fgfr3^G369C/小鼠，即ACH小鼠）交配，子代杂合子小鼠（Pten^flox/＋：ACH）之间再交配，获得Pten^flox/flox：ACH小鼠；通过Col2αCre：Pten^flox/flox和Pten^flox/flox：ACH交配即可获得在软骨细胞中特异性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠（Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH）。采用PCR对小鼠基因型进行鉴定，免疫荧光染色检测PTEN基因的敲除效率，通过X光平片摄影对小鼠的表型进行初步分析。结果获得了在软骨细胞中敲除PTEN的FGFR3点突变小鼠，免疫荧光染色证实Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠软骨细胞中PTEN蛋白因为基因敲除而表达很低。初步的表型分析显示：Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠身长、尾长均较Pten^flox/flox：ACH小鼠长（P〈0．05，n=5）。Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠表型，较Pten^flox/flox：ACH小鼠的侏儒表型有所缓解。结论采用基于Cre／LoxP系统的条件性基因敲除策略，获得了在软骨细胞中敲除PTEN基因的FGFR3增强型突变小鼠，表型分析初步显示，软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3增强型点突变所导致的小鼠侏儒表型。该小鼠的获得，为研究P13K／AKT信号通路在FGFR3突变介导的软骨生长抑制中的作用提供了实验动物平台。

如何培养学生良好的预习习惯

众所周知,预习习惯是学习习惯的一个重要方面。培养学生的预习习惯,是培养学生自主学习能力的关键。一、预习的重要性首先,我在班级对＂你怎么看待预习＂做了一个问卷调查,共收回有效问卷66份。其调查数据结果如下：选择＂不必预习＂的占68.4%;选择＂要进行浏览性预习＂的占11.6%;选择＂边预习边思考,带着问题听课＂的占15%;选择＂要预习,有问题及时主动请教他人＂的占5%。以上数据表明相当一部分学生觉得预习不重要,所以小学中高年级的教师如果不注重培养学生的预习能力,学生就会对预习的重要性缺乏足够的认识,就会影响学生预习能力的提高。因此,教师必须先让学生从思想上懂得预习的重要。

农村学校也有条件实施体育目标管理

我校是一所乡镇级的农村普通中学,现有高,初中十九个教学班,学生一千二百多人。由于校医狭窄,设备简陋,加上师资短缺,长期以来体育活动开展不正常。贯彻中、小学体育卫生工作两个《暂行规定》,曾三次推迟验收。 1986年,学校实施校长任期目标责任制,决心改变体育落后面貌。首先,组织教师学习。

校长应怎样科学地组织实施体育目标管理

“提高我国民族素质,为社会主义建设培养德智体全面发展的合格人才。”这是当前体育体制改革的根本目的。实施校长任期目标责任制,管理者责任之一,就在于正确地确定目标和系统地实施目标。作为一个校长,应怎样科学地组织和实施体育目标管理呢?1 观念,不断更新“体者,为知识之载而为道德之寓者也。”“德育是灵魂,智育是关键。

培养学生良好学习习惯例谈

某生今年11岁,六年级,聪明,有礼貌;自信心很强,很有上进心;个性倔强,只听得进表扬,听不进批评。也许是由于生长发育迟的缘故,看起来就像是三年级的同学;爱幻想,上课喜欢发呆;很好玩,家庭作业拖拖拉拉,明明是少则半小时、多则一小时的作业,他都能写两个小时以上。做作业时，常常做一些与作业无关的事：有时抠抠手指甲，有时拿喜欢的东西玩玩，有时发呆幻想自己去了一个没有父母管束的世界……低年级由于作业比较少，他的行为没有引起老师和家长的重视，直到高年级，

贵阳市生活饮用水水质调查一例

通过对屋顶水箱水、家庭自备水箱水、隔夜自来水管水和新鲜自来水的检测分析,结果表明:饮用水中含三氮量变化较大,其中亚硝酸盐氮(NO_2^--N)和氨氮(NH_3-N)在隔夜自来水和家庭自备水箱水中有明显升高,高于贵阳市卫生饮用水的参考指标,人们长期饮用此水可能影响人体健康,为此提出了对策建议。

中草药《抗感冒片》制剂工艺改进

此片剂几年来在我院临床应用,疗效确切。但处方中的中草药数多量大,其化学成分极为复杂,其中的无效成分(如树胶、树脂、粘液汁等),如处理不当,不易除去。这些杂质且易吸潮而使处方中的阿斯匹林水解和维生素C 的迅速破坏,因而大大降低其疗效。综上所述原因,我们进行了反复试验,进行了制剂工艺流程的改革,取得了比较满意的效果。

增强科技意识 加大执法力度 加速科技进步

喜读《人民日报》5月5日的报道: 5月的中南海,柳绿花红.春意盎然。3日下午。中共中央邀请各民主党派,全国工商联负责人和无党派人士代表到中南海怀仁堂座谈.征求他们对《中共中央、国务院关于加速科学技术进步的决定》(修改稿)的意见。会上,李鹏总理指出,今年是《中共中央关于科学技术体制改革的决定》发布10周年。10年来,我国科学技术有了很大进步.