半边旗抗肿瘤有效成分6F对HL-60细胞周期的影响及体外增效作用

目的：研究半边旗抗肿瘤有效成分６Ｆ对ＨＬ－６０细胞周期的影响及对常用抗肿瘤药的体外增效作用。方法：应用流式细胞光度术（ＦＣＭ）测定细胞周期，应用噻唑蓝（ＭＴＴ）法测定药物对细胞的抑制率。结果：不同浓度６Ｆ作用６小时即可使ＨＬ－６０细胞Ｓ期及Ｇ２／Ｍ期比例升高，Ｇ１期比例下降，并呈一定的剂量效应关系，当作用到２４小时后，Ｓ期比例进一步升高，但Ｇ２／Ｍ期比例稍有回落。低浓度６Ｆ分别与２－氯代脱氧腺苷（２－ＣＬｄＡｄｏ），顺铂（ＣＤＤＰ），长春新碱（ＶＣＲ），氟尿嘧啶（５ＦＵ）合用可增强它们对ＨＬ－６０细胞的杀伤作用，ｑ值大于０．８５，与各药有相加或协同作用，６Ｆ对２－ＣｌｄＡｄｏ，ＣＤＤＰ，ＶＣＲ，５ＦＵ的增效倍数分别为１．５８，１．５３，１．５５，１．３８。结论：６Ｆ可明显阻断ＨＬ－６０细胞在Ｓ期及Ｇ２／Ｍ期；６Ｆ可增强上述药物对ＨＬ－６０细胞的杀伤作用。已知，２－ＣｌｄＡｄｏ阻断细胞在Ｓ期，ＣＤＤＰ和ＶＣＲ阻断Ｇ２／Ｍ期，５ＦＵ阻断Ｇ１期。鉴于所试药物对细胞周期的影响不同，提示６Ｆ的体外增效作用可能与此有关。

bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文)

背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA

半边旗提取物6F抑制HL-6 0细胞蛋白激酶C活性(英文)

目的 探讨半边旗提取物 6F的细胞毒作用及诱导DNA片段化与蛋白激酶C(PKC)信号转导途径的关系 ,检测 6F对PKC活性的影响。方法 受试对象为HL 6 0细胞 ,超速离心法获得的胞液 (可溶部分 )及颗粒 (不可溶部分 ,包括细胞膜系统及胞核 )部分用作PKC活性测定。经 0 .4g·L- 1磷脂酰丝氨酸 ,0 .0 4g·L- 1甘油二油酸酯激动剂作用酶粗提物后 ,用液体闪烁计数仪计数 [γ 32 P]ATP参入外源底物的量以测定PKC活性。MTT法测定HL 6 0细胞的活力 ,二苯胺法测定 6F诱导DNA片段化程度。结果 在所测试的浓度范围内 (0 .5～ 312 μmol·L- 1) ,化合物 6F显著抑制胞液及颗粒部分PKC活性 ,最大抑制率达 88.6 % ,呈浓度依赖关系 (胞液部分r =0 .781,P <0 .0 5 ,颗粒部分r =0 .931,P <0 .0 1)。 6F诱导HL 6 0细胞DNA片段化及对细胞的毒性作用可被具有致癌作用的PKC激活剂肉豆蔻酸酯 (PMA ,浓度为 6 5nmol·L- 1)拮抗 ,抑制率分别是 30 %和 4 4% (P <0 .0 1)。PMA单独用使HL 6 0细胞线粒体将MTT还原为甲月赞的能力增强 14 % (P <0 .0 1) ,即增强细胞活力。结论化合物 6F是PKC的抑制剂。 6F对HL 6

钙离子在半边旗提取物6F的细胞毒及诱导HL-60细胞DNA片段化中的作用

目的 :研究蕨类植物半边旗提取物 6F对HL - 6 0细胞内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)及Bcl- 2蛋白表达的影响 ,Ca2 + 与 6F细胞毒作用及诱导细胞DNA片段化的关系。方法 :用荧光探针Fura - 2 /AM标记细胞内游离Ca2 + ,在荧光分光光度计上测 [Ca2 + ]i;流式细胞仪检测Bcl- 2的表达 ;噻唑蓝 (MTT)法测定细胞成活率 ;二苯胺法测DNA片段化形成率。结果 :6F作用后 ,HL - 6 0细胞内 [Ca2 + ]i 显著升高 ,呈明显的时间剂量效应关系 ;6F降低Bcl- 2的表达 ;于培养基中加 2mmol/LCa2 + 、或加 1mmol/LEDTA络合细胞外钙 ,或加 4 μmol/L钙通道A2 3 187升高细胞内钙浓度 ,均可增强 6F的细胞毒作用 ,但均不影响 6F诱导细胞DNA片段化程度。加入 2 5 0 μmol/LZn2 + 可显著降低 6F所致DNA片段化率 ,并可增强 6F的细胞毒作用。结论 :化合物 6F可显著升高HL - 6 0细胞 [Ca2 + ]i,推测与 6F降低Bcl- 2的表达有关 ;6F诱导HL - 6 0细胞DNA片段化可能是通过Ca2 + -非依赖性DNA酶的作用所致。

半边旗抗肿瘤有效成分6F对HL-60细胞c-Myc、Bcl-2及PCNA表达的抑制作用

目的 :研究蕨类植物半边旗提取物 6F对 HL- 60细胞内 c- Myc、Bc1 - 2及增殖细胞核抗原 (PCNA)表达的影响 ,探讨其抗肿瘤作用机制。方法 :异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的抗体与细胞反应后在流式细胞仪上检测上述三种蛋白的表达水平。结果 :58～ 2 31 nmo1 / L 6F作用 HL- 60细 1 2 h后 ,c- Myc、Bc1 - 2及 PCNA蛋白表达水平明显下降 ,并呈剂量效应关系。结论 :化合物 6F可下调 HL- 60细胞 c- Myc、Bc1 - 2及 PCNA的表达水平 ,推测这是 6F对 HL - 60细胞具有强烈细胞毒作用并诱导其细胞凋亡的机制之一。

鼠白细胞介素-2受体α、β链基因反义RNA真核表达质粒的构建

【目的】构建鼠IL 2Rα与β链基因的反义RNA真核表达质粒 ,为反义RNA基因治疗细胞免疫相关疾病作准备。【方法】用限制性内切酶从克隆载体上切下鼠IL 2Rα与β链cDNA及鼠IL 2启动子 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3的多克隆位点上 ,用酶切或PCR法鉴定正反连接。【结果】得到 4个反向连接的重组质粒 :pcAnti mIL 2Rα ,pcAnti mIL 2Rβ,pcAnti mIL 2Rαβ及pciAnti mIL 2Rαβ。前三者由CMV强启动子指导鼠IL 2R基因反义RNA的表达 ,后者由CMV启动子与鼠IL 2靶向可诱导型启动子组成的融合启动子指导反义RNA的表达。【结论】成功构建了 4个不同类型的鼠IL 2R基因反义RNA真核表达质粒。

半边旗抗肿瘤有效成分6F对HL-60细胞的DNA、RNA及蛋白质生物合成的抑制作用

目的 :从 DNA、RNA及蛋白质生物合成的角度探讨半边旗有效成分 6F抗肿瘤的作用机理。方法 :用台盼蓝拒染法测定细胞成活率 ;[3H] - Td R,[3H] - UTP和 [3H] - Leu参入法分别测定细胞 DNA、RNA及蛋白质生物合成的水平。结果 :6F对 HL - 60细胞生长有强烈的抑制作用 ,且具明显的时间和剂量效应关系。 6F明显抑制 HL- 60细胞 DNA、RNA及蛋白质生物合成 ,呈剂量依赖关系。 6 F对蛋白质合成的抑制作用最强。结论 :6F对 HL- 60细胞生长有强烈的抑制作用 ,抑制细胞 DNA、RNA,特别是蛋白质的生物合成是 6F抗肿瘤作用的可能机制之一。

半边旗提取物6F诱导HL-60细胞凋亡

目的 :探讨蕨类植物半边旗提取物 6F杀伤HL 60细胞的作用机制。方法 :应用倒置显微镜观察细胞形态、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞光度术、DNA片段形成率等方法检测细胞凋亡。结果 :5 8～ 2 31nmol L 6F作用HL 60细胞 12～ 2 4h后 ,呈现典型的凋亡细胞的形态学改变 ,琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯状条带 ,流式细胞光度术结果显示有亚倍体 (Sub G1)峰 ,DNA片段率结果显示 6F诱导HL 60细胞凋亡呈时间和剂量效应关系 ,6F达到 2 9μmol L时只需作用 3h即可直接使细胞坏死。 结论 :6F可诱导HL 60细胞凋亡 ,药物在一定的浓度范围内是其杀伤HL

半边旗提取物对HL-60细胞的细胞毒作用及对细胞周期的影响

目的 :研究蕨类植物半边旗提取物对HL 60细胞的体外杀伤作用及对细胞周期的影响。方法 :用噻唑蓝 (MTT)法测定细胞成活率 ;用流式细胞术测定细胞周期时相分布。结果 :半边旗乙醇总提取物PSE及纯化合物 5F、6F及A对HL 60细胞有强烈的杀伤作用 ,具明显的时间和剂量效应 ;PSE、5F、6F及A作用HL 60细胞 2 4h后 ,G0 /G1期细胞比例明显下降 ,S期细胞比例明显升高 ,G2 /M期轻度升高 ( 5F作用组例外 )。结论 :半边旗提取物对HL 60细胞有强烈的杀伤作用 ,明显影响细胞周期时相分布。

半边旗提取物6F对HL-60细胞还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响

目的 :观察半边旗提取物 6F对 HL- 60细胞内还原型谷胱甘肽 (GSH)水平的影响 ,从氧化机制探讨其抗肿瘤作用的机理。方法 :用邻苯二醛 (OPT)荧光分光度法测定细胞内还原型谷胱甘肽。结果 :58至 2 31 nmo1 / L 6F作用细胞 2 0 h及 2 31 nmo1 / L 6F作用细胞 6至2 4 h,HL - 60细胞内 GSH含量均明显降低 ,呈明显的时间剂量效应关系。结论 :化合物 6F可降低 HL- 60细胞内还原型谷胱甘肽水平 ,推测通过细胞内氧化机制杀伤 HL- 60细胞并诱导其细胞凋亡是化合物 6F抗肿瘤作用机制之一。

RNAi技术在大规模基因功能研究中的应用

由双链RNA诱导的基因沉默现象称为RNA干涉(RNAi)。RNAi的高效率、高特异性以及能在细胞内简易地进行人工诱导,特别是在哺乳动物细胞内成功诱导RNAi及成功应用表达载体等,使RNAi作为一种反向遗传技术广泛应用于基因功能的研究,特别是能够在真核生物基因组水平大规模高通量地研究基因功能。现就近年来关于RNAi技术在大规模高通量基因功能方面的研究进展作一综述。

体外导入IL-2R反义RNA表达质粒对小鼠脾细胞活化增殖的影响

目的 观察导入白细胞介素 2受体 (IL 2R)反义RNA真核表达质粒对体外培养的小鼠脾细胞活化增殖的影响及其机制的探讨。方法 用粘附辅助脂质体法把IL 2R反义RNA真核表达质粒转染脾细胞 ,用丝裂原刺激脾细胞活化增殖 ,MTT法检测细胞生长情况。狭线杂交法检测IL 2RmRNA的表达水平 ,流式细胞仪检测IL 2R的蛋白表达水平。结果 转染各重组质粒后 ,脾细胞的生长增殖受到明显抑制 ,且 pcAnti mIL 2Rαβ与 pciAnti mIL 2Rαβ组抑制率较 pcAnti mIL 2Rα及pcAnti mIL 2Rβ组的大 ,pcAnti mIL 2Rα组抑制率较pcAnti mIL 2Rβ的大。转染各重组质粒对NIH3T3细胞生长增殖无影响。转染各重组质粒后IL 2RmRNA及蛋白表达水平明显降低。结论 IL 2R反义RNA能有效抑制体外培养的小鼠脾细胞的生长 ,IL 2Rαβ融合基因反义RNA较α、β单基因反义RNA的抑制率高 ,IL 2Rα反义RNA较 β反义RNA抑制率高。初步推断 ,IL 2R反义RNA抑制细胞生长的作用是特异的 ,只针对功能性表达IL 2R的细胞。反义RNA封闭IL

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。

一种质粒介导的RNAi系统的建立

目的 构建mU6启动子驱动的，在真核细胞内表达短发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)的质粒载体；以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)为靶点观察该载体介导的RNAi效应。方法 从已知质粒中获取mU6启动子，经亚克隆后替换pcDNA3质粒中的CMV启动子，构建成pmU6质粒；设计并构建能表达针对GFP的shRNA的重组质粒，与表达GFP的质粒共转染细胞，用流式细胞仪检测GFP的表达水平。结果 表达shRNA的pmU6质粒载体转染细胞后抑制了细胞中GFP的表达，针对GFP基因不同位点的shRNA的RNAi效应差异很大。结论 pmU6质粒载体能介导RNAi效应，该载体可作为RNAi用于基因功能和基因治疗研究的有用工具。

半边旗5种成分体外细胞毒活性比较及构效关系分析

用多种人癌细胞株以ＭＴＴ试验，体外筛选半边旗抗肿瘤活性成分。结果显示：化合物５Ｆ，６Ｆ，Ａ及半边旗乙醇提取物ＰＳＥ对５种人癌细胞均有不同程度的杀伤作用，且呈明显的剂量依赖关系。其中６Ｆ的活性最强，其次是Ａ，５Ｆ，而化合物４Ｆ和Ｂ对５种细胞均无细胞毒活性。分析它们的构效关系可以推测，αβ亚甲基环戊酮结构是其活性部位，结构中羟基数目和位置的不同可以影响化合物的活性强度。