293T细胞生产慢病毒工艺优化

随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^(2+)浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^(*)P<0.05)。Ca^(2+)浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^(2+)浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。

HPV18间隔序列介导真核基因以双顺反子形式表达

HPV18是一种DNA病毒,其E6和E7基因可读框(ORF)相隔8个核苷酸,以双顺反子形式在宫颈癌细胞HeLa细胞中表达E6和E7蛋白。为探究此间隔序列是否在基因双顺反子表达中发挥关键作用,利用此序列构建2个双顺反子表达质粒,转染人胚胎肾细胞HEK293T细胞,检测上下游2个ORF表达水平。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示2个ORF同时转录,免疫印迹(Western blot)结果显示2个蛋白同时表达,荧光显微镜结果进一步显示红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)共表达。以上结果证明HPV18 E6和E7基因间隔序列可在上游ORF翻译结束后重新启动下游ORF翻译。此现象在真核细胞中比较罕见,分子机制可能与核糖体重新结合有关,值得进一步探究。

基于体外发酵模型分析植物多糖对T2DM患者肠道菌群及代谢的影响

通过体外发酵模型,利用高通量测序及代谢组学技术,研究5种植物多糖(黄芪多糖、苍术多糖、玄参多糖、红枣多糖和乌梅多糖)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者肠道微生物及其代谢产物的影响。结果表明,植物多糖能够显著改善糖尿病人肠道菌群结构,并且5种多糖均能够富集Faecalibacterium、Roseburia,抑制Escherichia。植物多糖处理能够调节气体介质含量、短链脂肪酸含量,改变T2DM患者肠道菌群的氨基酸、短链脂肪酸代谢途径,其中黄芪多糖、苍术多糖和玄参多糖对短链脂肪酸总量调节作用显著,对乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸含量具有一定的调节作用;黄芪多糖、苍术多糖、玄参多糖和红枣多糖均能够提高T2DM患者的总气体介质含量以及CO_(2)和CH_(4)含量,乌梅多糖降低了总气体介质含量和H_(2)S含量。研究结果为植物多糖的筛选与利用及其靶向调节肠道微生物提供了理论基础。

基于网络药理学和分子对接分析赤芍抗氧化应激作用的活性成分及其机制

【目的】利用网络药理学及分子对接技术分析赤芍抗氧化应激作用的有效活性成分及其分子机制。【方法】运用TCMSP数据库搜集赤芍的活性成分和靶点,借助UniProt数据库对靶点进行基因名转化;通过GeneCards和OMIM数据库检索氧化应激的相关基因,利用Veeny在线平台获得赤芍与氧化应激的交集靶点,将交集靶点上传至STRING数据库和Cytoscape 3.8.0软件建立蛋白互作(PPI)网络图和赤芍-靶点-氧化应激可视化网络并进行拓扑学分析,筛选关键靶点;运用Metascape数据库对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,确定赤芍发挥抗氧化应激作用的活性成分和信号通路;运用AutoDock和PyMol软件对赤芍发挥抗氧化应激作用的核心靶点进行分子对接验证。【结果】共筛选到12个赤芍活性成分,包括黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-儿茶素等;赤芍活性成分与氧化应激靶点分别有76和4873个,其中赤芍与氧化应激交集靶点共69个,包括蛋白激酶B(AKT1)、转录因子AP-1(JUN)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)和半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)等;GO功能和KEGG通路富集结果提示,赤芍抗氧化应激与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、核因子κB(NF-κB)等多个信号通路有关;分子对接结果表明,赤芍主要活性成分黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点有较好的结合能力。【结论】赤芍可能通过黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸等活性成分调控PI3K-Akt、NF-κB、白细胞介素-17(IL17)等信号通路中的关键靶点来发挥抗氧化应激作用。

乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的生物活性研究

以一株从酱香型白酒酒醅中筛选分离的乳酸片球菌Pediococcus acidilactici HAO2018为研究对象,探究菌株耐酸、耐胆盐特性及耐药性;用乙醇沉淀法提取该菌株胞外多糖(exopolysaccharides,EPS),对其抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性进行评价。结果表明,乳酸片球菌HAO2018具有较好的耐酸、耐胆盐能力,对卡那霉素等多种抗生素敏感,对万古霉素、复方新诺明不敏感;其EPS的DPPH自由基、羟自由基清除率以及还原能力均以浓度依赖的方式增加,当EPS质量浓度为1.0 mg/mL时,对DPPH的清除率为(68.46±4.16)%,当EPS质量浓度为10.0 mg/mL时,还原力以及羟自由基清除率分别为(54.10±0.15)%、(83.43±3.87)%;HAO2018的EPS对食源性致病菌志贺氏菌和阪崎克罗诺杆菌具有显著的抑制效果;EPS的抗肿瘤活性呈现浓度依赖性,0.5~2 mg/mL的EPS作用48 h和72 h时显著地抑制HT-29细胞的增殖。该研究对乳酸片球菌胞外多糖的综合开发利用提供一定理论基础。

含铁牛血肽改善大鼠缺铁性贫血的效果评价

为开发牛血肽相关功能性产品提供理论依据,作者研究了含铁牛血肽对于大鼠缺铁性贫血的治疗效果。以低铁鼠粮饲喂初离乳雌性SD大鼠3周,建立缺铁性贫血模型。以含铁鼠粮为正常对照,以生血宁为阳性对照,用含铁牛血肽灌胃至血红蛋白质质量浓度达到100 g/L以上。结果表明:含铁牛血肽显著地改善了缺铁性贫血引起的大鼠体质量以及白细胞、红细胞、血红蛋白和红细胞压积等血常规指标的下降,同时改善铁代谢指标血清铁和血清铁蛋白。低剂量牛血肽效果相当于生血宁,中高剂量牛血肽效果优于生血宁,证明饲喂含铁牛血肽可以改善大鼠缺铁性贫血。

阴道益生菌制剂在女性生殖道疾病治疗中的应用研究概述

健康育龄女性下生殖道分布着大量的微生物,其中的优势菌群是维持阴道酸性环境的乳杆菌.女性生殖道微生态紊乱与下生殖道感染、生殖道恶性肿瘤、不孕等关系密切.应用阴道益生菌制剂是改善生殖道微生态紊乱的有效方法.研究证明,口服或阴道外用益生菌制剂具有辅助治疗下生殖道感染、辅助清除高危型人乳头瘤病毒、改善孕妇阴道微生态环境以及预防早产等作用.本文对阴道益生菌制剂在女性生殖道疾病治疗中的基础和临床研究进展进行综述,探讨阴道益生菌制剂相关的问题.

人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇基因在E.coli细胞中的表达

目的:探索在E.coli BL21中表达hTPO抗原决定簇片段(AA568～AA874)。方法:将hTPO抗原决定簇基因(1702～2622,编号相对于起始密码子)连接到表达型载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒。然后转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。表达产物采用亲和层析方法纯化,SDS-PAGE法测定其分子质量,ELISA法鉴定免疫学活性,考马斯亮蓝染色法定量。结果:成功地表达了hTPO抗原决定簇基因。纯化的GST-hTPO融合蛋白分子质量为61.4 ku,hTPO片段分子质量为37.6 ku。以此作为抗原按ELISA法分别与TPOAb阳性血清或阴性血清反应,结果表明GST-hTPO及hTPO片段均与TPOAb特异性结合。纯化的GST-hTPO产量为10 mg/L培养基;hTPO片段产量为1.2 mg/L培养基。结论:利用基因工程技术可获得高纯度的GST-hTPO融合蛋白及hTPO片段,产物具有良好的免疫学活性。

本科生全程导师制的实践探索

国内多数高校实行了本科生全程导师制,这是一种促进生师交流,强化因材施教,提高本科生培养效率的教育方式。尽管在全程导师制施行初期会出现导师职责不明确、考核方法不完善等问题,但是经过几年的实践探索证明全程导师制对本科生规划大学生活、制定学习目标、提高创新能力、及时心理疏导等多方面具有明显的优势。

MALAT1通过竞争miR-124上调SMYD3并促进乳腺癌细胞增殖与迁移

为了探究lncRNA MALAT1是否会通过与组蛋白甲基化酶SMYD3间的相互调控对乳腺癌细胞的增殖和迁移产生影响,采用siRNA敲低MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞中的内源性MALAT1后,然后应用划痕和MTT法检测细胞迁移和增殖情况;实时定量PCR(RealtimePCR)、免疫蛋白印迹(Westernblot)等方法检测si-MALAT1对miRNA-124、SMYD3及其下游基因mRNA及蛋白质水平的影响。结果显示:siRNA靶向敲低MALAT1后可降低乳腺癌细胞的迁移和增殖速度,同时抑制SMYD3及其下游靶基因N-cadherin、MYL9、MMP9、CYR61等的转录表达,并上调miR-124。miR-124的过表达可降低SMYD3在乳腺癌细胞中的表达,且MALAT1的敲低可以缓解miR-124抑制剂对SMYD3蛋白质水平表达的促进作用。此外,转染外源质粒使SMYD3过表达可激活MALAT1转录,反之siRNA干扰SMYD3后则会下调MALAT1。研究结果表明:lncRNAMALAT1可以作为miR-124的ceRNA调控SMYD3,同时SMYD3可反馈性激活MALAT1的转录,这一相互调控作用将影响到乳腺癌细胞的增殖与迁移能力。

一个新型检测人甲状腺过氧化物酶抗体ELISA技术的临床应用

目的:以重组人甲状腺过氧化物酶(hTPO)为抗原检测人甲状腺过氧化物酶抗体(hTPOAb)的ELISA用于甲状腺疾病临床检测。方法:用该法测定552例正常人,各类甲状腺疾病患者592人次,包括Graves病(GD)364人次(初诊64例及复诊300人次),桥本氏病(HT)142例,单纯甲状腺肿34例,亚急性甲状腺炎23例,结节性甲状腺肿19例,腺瘤10例。结果:确立本法阳性切限为A405值P95为0.74,测定各类甲状腺疾病患者hTPOAbA405值结果以中位数(M)表示,HT为1.19,阳性率87.32%;Graves’病治疗前是0.51,阳性率26.56%,治疗后为0.62,阳性率30.67%;亚急性甲状腺炎为0.48,阳性率为17.39%;单纯甲状腺肿为0.58,阳性率为0;结节性甲状腺肿为0.69,阳性率21.05%;腺瘤为0.68,阳性率20%。HT患者血清hTPOAb阳性率明显高于其他各组(P<0.01)。结论:以重组hTPO为抗原建立的ELISA法特异、稳定、简便,可以常规应用于临床,并可作为HT的特异性诊断手段。

以肌动蛋白为标准化参数在甲状腺乳头状癌中c-fos表达的研究

目的 :引入细胞管家基因 (β-actin)作为多重扩增的内参照物以达到资料比较的标准化 ,用于研究c -fos在甲状腺乳头状癌中的表达。方法 :14例甲状腺乳头状癌组织标本 ;21例正常对照包括3例乳头状癌病变旁正常甲状腺组织和18例腺瘤病变旁正常甲状腺组织。采用Trizol法提取总RNA ,逆转录 -聚合酶链反应法 (RT -PCR)获取cDNA ,多重聚合酶链反应 (MultiplePCR)法同时扩增371bp的c -fos和227bp的β-actin。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,用UVP凝胶成像分析系统的GelBase/GelBiot -Pro分析软件获取各标本c-fos和β-actin的密度值 ,计算两者的比值。结果 :正常对照和乳头状癌组c -fos/β-actin比值分别为 (x±s) :0.6845±0.0753和0.5938±0.0969 ,两组存在着显著差异(t=2.954,P<0.01) ;经自身配对t检验 ,3例患者的癌变组织明显低于与此癌病变旁的正常组织(t=9.205 ,P<0.05)。结论 :c -fos在甲状腺乳头状癌组织中的表达明显低于正常对照。

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .

Graves'病和Hashimot病患者可溶性细胞间粘附分子-1的研究

目的 :研究单纯甲状腺肿、Graves'病和Hashimot病患者血清sICAM -1的含量。方法 :用本室研制的sICAM -1RIA ,检测本市400例正常人以及1020例患有单纯性甲肿、Graves'病或者Hashimoto病患者血清sICAM -1含量 ,进行比较分析。结果 :正常人检测结果 (x±s)为 :168.43±36.23μg/L。单纯性甲肿组与正常组无显著性差别 (P>0.05) ,两种自身免疫性甲状腺疾病 (Graves'病和Hashimoto)均明显高于正常组和单纯性甲肿组(P<0.05)。3种治疗均可降低Graves'病患者sICAM -1含量 (P<0.05)。Graves'病停药复发组sICAM -1含量明显高于药物治疗后甲状腺功能恢复正常的Graves'病组(P<0.05)。结论 :sICAM -1RIA可用于临床检测自身免疫性甲状腺疾病 ;血清sICAM -1含量可作为自身免疫性甲状腺疾病诊断的一个参考指标 ,并在临床评价Graves'病的疗效、停药和复发等方面具有重要意义。

组蛋白乙酰转移酶p300对人乳腺癌细胞迁移的影响

在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染p300表达质粒过表达p300,及利用si RNA干扰技术下调p300的表达,以此研究组蛋白乙酰转移酶p300对肿瘤细胞迁移的影响.体外细胞划痕实验表明,过表达p300可以促进MDAMB-231细胞的迁移.RT-PCR和免疫印迹实验(Western blot)结果表明,过表达p300导致肿瘤迁移相关基因MYL9、CYR61和MYH9的m RNA和蛋白表达水平的上升.与过表达p300相反,干扰p300的表达引起肿瘤迁移相关基因MYL9、CYR61和MYH9的m RNA和蛋白表达水平的下调.

共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19/CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞的开发与应用

目的初步探讨共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的anti-CD19 CAR-T细胞的功能特性及其在体外对人CD19^+急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞各项功能,增强其对血液瘤、实体瘤的治疗效果。方法通过亚克隆技术获得重组慢病毒质粒,慢病毒包装,转导原代T细胞获得2种第4代anti-CD19CAR-T细胞,分别命名为7×19 CAR-T细胞、7×21 CAR-T细胞。借助流式细胞仪和相关试剂盒检测了细胞CAR分子的转导效率、CAR-T细胞的趋化能力、增殖及凋亡情况等;钙黄绿素释放法检测CAR-T细胞的杀伤作用;共培养法检测CAR-T细胞因子的释放情况;2种第4代anti-CD19 CAR-T细胞组皆于原代T细胞、常规anti-CD19 CAR-T细胞作比较。结果7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞的功能特性皆有显著提高,主要表现在细胞增殖速度加快、细胞凋亡速率明显变慢、炎症因子IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量皆有所增加;且体外杀伤实验表明阳性率约40%的7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞对CD19^+肿瘤细胞Raji的杀伤效率高于阳性率约50%anti-CD19 CAR-T细胞(P<0.01);结论实验数据显示共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞即7×19 CAR-T和7×21 CAR-T细胞相比第3代anti-CD19 CAR-T细胞和T细胞在趋化能力、细胞增殖、细胞凋亡、体外杀瘤效果以及细胞炎症因子的释放能力等方面皆有显著改善,初步证明了7×19 CAR-T细胞和7×21 CAR-T细胞的各项功能有所优化,对CD19^+人急性淋巴细胞白血病治疗效果得到改善,为开发靶向CD19的新型CAR-T细胞提供了新思路,这种模式也为其它类型CAR-T细胞的开发开创了典范。

抑制DNMT3A促进E2F1诱导间充质干细胞向动脉内皮细胞分化及血管生成

目的:探讨敲减DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)的表达是否促进细胞周期相关转录因子E2F转录因子1(E2F1)诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向动脉内皮细胞分化及血管形成。方法:体外培养hUCMSCs,将细胞分为对照组、E2F1过表达组(E2F1组)、DNMT3A敲减组(siDNMT3A组)和联合诱导组(E2F1+siDNMT3A组);倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用RT-qPCR和Western blot检测动脉特异性标志物ephrin-B2和HEY2的mRNA及蛋白水平;成管实验检测分化后hUCMSCs的体外管状结构形成能力;裸鼠基质胶塞实验结合CD31染色检测分化后hUCMSCs的体内生成血管情况。结果:RT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,siDNMT3A组ephrin-B2和HEY2的mRNA及蛋白水平均显著升高(P<0.01);与siDNMT3A组相比,E2F1+siDNMT3A组HEY2和ephrin-B2的mRNA及蛋白水平进一步升高(P<0.01)。体内和体外成管实验证明,除对照组外,其他3个诱导组的细胞均可形成管腔样结构,其中E2F1+siDNMT3A组的成管能力最强。结论:与单一过表达E2F1或敲减DNMT3A比较,敲减DNMT3A表达同时过表达E2F1的hUCMSCs向动脉内皮细胞分化和血管形成能力更强。

SAHA对HeLa细胞增殖、凋亡、衰老以及迁移的影响

为研究HDAC抑制剂SAHA对宫颈癌HeLa细胞肿瘤生物学特性的影响,使用SAHA处理HeLa细胞后,在显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色法检测细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡,β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老,划痕实验和小室迁移实验检测细胞迁移能力,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)检测基因表达.结果显示:SAHA处理HeLa细胞后,细胞增殖能力下降,发生衰老,同时在分子水平上促进p21基因表达;抑制细胞迁移,在分子水平上迁移相关基因MYL9表达水平下降;SAHA处理的细胞没有表现出明显凋亡现象.本研究结果提示SAHA可能通过促进p21和MYL9基因表达发挥抑制细胞增殖、促进细胞衰老和降低细胞迁移能力的作用.

HDAC抑制剂SAHA抑制人乳腺癌细胞MCF-7的迁移和增殖

用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase complex,HDAC)抑制剂SAHA对人乳腺癌细胞MCF-7进行处理,抑制组蛋白的去乙酰化,进而检测SAHA对MCF-7的影响.体外划痕实验与Transwell实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的迁移;免疫印迹(Western blot)实验表明SAHA可以抑制迁移相关基因MYL9蛋白水平的表达.MTT实验和克隆形成实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖;Western blot实验与逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验表明SAHA能够抑制细胞周期蛋白标志基因CyclinD1、CDK4的表达,促进周期蛋白激酶抑制剂p21的表达.