香葱伴生番茄对青枯病及根际微生态特征的影响

【目的】为明确香葱伴生对番茄青枯病及根际微生态特征的影响,揭示香葱伴生番茄降低青枯病发病率的机理。【方法】通过田间试验设置番茄单作和香葱伴生番茄2个处理,分别采集单作发病番茄(QK)、单作健康番茄(NBS)和香葱伴生番茄(BS)的根际土壤,应用16S rDNA高通量测序和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术,探究香葱伴生对番茄根际微生态特征的影响。【结果】田间试验结果表明,番茄单作处理和香葱伴生番茄处理的青枯病平均病株率分别为50.48、31.43%,香葱伴生番茄处理对番茄青枯病的防治效果为37.74%。16S rDNA高通量测序结果表明,BS、NBS根际土壤细菌群落相对丰度和多样性均显著高于QK;与QK相比,BS和NBS根际土壤细菌茄科雷尔氏菌属相对丰度显著降低,而芽孢杆菌属相对丰度升高;与NBS相比,BS根际土壤细菌茄科雷尔氏菌属相对丰度降低,芽孢杆菌属相对丰度显著提高。利用LC-MS技术共鉴定出番茄根际土壤代谢物586种,其中正离子模式代谢物320种,负离子模式代谢物266种,并将代谢物的功能注释至新陈代谢、遗传信息加工和环境信息加工等代谢通路;与NBS相比,BS根际土壤代谢物中的缬氨酸、L-天冬酰胺和柠檬酸的含量均显著降低,L-赖氨酸、谷氨酸、D-谷氨酰胺和异亮氨酸的含量也低于NBS,但差异未达到显著水平。【结论】香葱伴生番茄显著降低番茄青枯病田间发病率,改变了番茄根际土壤中细菌群落结构和番茄根际土壤代谢物含量。

广东烟粉虱传双生病毒的发生种类、分布及动态

为了监测烟粉虱传双生病毒在广东的发生与扩散动态,2003年-2021年,本课题组对全省烟粉虱传双生病毒进行了长期调查与监测。结果表明,在广东省广州、湛江、惠州等14市均有烟粉虱传双生病毒病的发生,危害的寄主植物有番茄、南瓜、甘薯等24种,其中番茄黄化曲叶病发生和危害尤为严重,广泛分布于全省各地;从14市采集的病样中共鉴定出烟粉虱传双生病毒21种,其中广东番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl Guangdong virus,TYLCGdV)、广东番茄曲叶病毒(tomato leaf curl Guangdong virus,ToLCGdV)、黄蝉曲叶病毒(Allamanda leaf curl virus,AllLCV)、广东雾水葛花叶病毒(Pouzolzia mosaic Guangdong virus,PouMGDV)、十萼茄黄花叶病毒(Lycianthes yellow mosaic virus,LyYMV)5种病毒为新种;同时,发现危害不同寄主的病毒种类存在差异,危害同一作物的病毒种类也存在动态变化。本文明确了广东烟粉虱传双生病毒分布广、种类多、危害重,为全省烟粉虱传双生病毒病的防控提供了科学依据。

广东番茄巨芽病植原体的分子鉴定

2022年,对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株,利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板,利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增,获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-2022)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为ON102780)。16S rRNA基因序列相似性分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组植原体菌株的相似性较高,为96.82%~100%,其中与隶属于16SrⅡ-V亚组的6个植原体株系相似性为100%。系统进化分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组各植原体株系聚类在一个大分支,并与16SrⅡ-V亚组成员聚类在一个小分支,亲缘关系较近。16S rRNA基因相似系数分析表明,TBB-GD-2022与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717)的相似系数为1.00。上述研究结果表明,广东番茄巨芽病植原体隶属16SrⅡ-V亚组成员。本文首次报道在广东发现番茄巨芽病,通过其16S rRNA序列分析进一步确定了其相关植原体的分类地位,为该病害的防控提供了科学依据。

广东省番茄白尖曲叶病病原鉴定及其致病性分析

【目的】洋桔梗耳突曲叶病毒(lisianthus enation leaf curl virus,LELCV)是2015年发现的菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒新种。论文旨在探究入侵中国内地的首个LELCV分离物Tomato-2022的分子特征、亲缘关系、致病性及有效传播介体,为防控该病毒病提供理论依据。【方法】2022年,在广东省广州市增城区发生一种番茄新病害,病株表现叶小、卷曲、叶尖白化症状,采集两份病样提取总DNA,利用Begomovirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得分离物Tomato-2022的基因组全长序列。采用BLASTn程序对病毒序列进行相似性检索并下载相似性较高的代表分离物序列,进一步用SDTv1.2的MUSCLE alignment方法进行序列相似性比对;利用软件MEGA7.0对获得的Tomato-2022基因组序列及已报道的相似性较高的代表分离物进行系统发育分析。应用酶切连接法构建Tomato-2022的侵染性克隆pGreenII0229-1.6A,通过农杆菌介导注射接种本氏烟叶片和番茄茎秆,测定其致病性。采取室内人工传毒方法,测定烟粉虱MEAM1隐种对分离物Tomato-2022的传播效率。利用LELCV的PCR特异引物对2021—2023年采集于广东省番茄主产区的135份番茄病样进行检测,明确该病毒在广东省的分布。【结果】PCR检测结果表明,两份表现叶小、卷曲、叶尖白化症状的番茄病样感染了菜豆金色黄花叶病毒属病毒。基因克隆与序列分析显示,该病毒分离物Tomato-2022基因组仅含DNA-A,大小为2757 nt,含有6个ORF。序列相似性比较表明,分离物Tomato-2022基因组序列与已登录GenBank的LELCV各分离物相似性较高,其中与LELCV中国台湾洋桔梗分离物(LC091539、LC091538)相似性最高,为98.33%。系统发育分析显示,Tomato-2022与LELCV的19个分离物聚在一个独立的分支,亲缘关系较近。利用构建的Tomato-2022侵染性克隆pGreenII0229-1.6A,农杆菌介导注射接种本氏烟和番茄,10 dpi,本氏烟上部叶叶缘轻微上卷,1株番茄的新叶轻微卷曲;18 dpi,本氏烟和番茄植株均表现较为明显的卷曲症状;随着接种时间的延长,接种植株的症状越来越明显,30 dpi,本氏烟表现叶脉肿大、叶片严重卷曲,番茄植株的叶片表现卷曲、叶尖白化;PCR检测表明,在接种发病本氏烟和番茄植株中均能检测到LELCV。室内传毒试验证明,烟粉虱MEAM1隐种能高效传播Tomato-2022,当每株番茄接1、5、10头饲毒48 h的烟粉虱时,MEAM1的平均传毒效率分别为26.67%、93.33%、96.67%。PCR检测结果表明,采集的135份番茄病样中,8份样品检测到LELCV,说明LELCV已在广东省定殖。【结论】Tomato-2022是洋桔梗耳突曲叶病毒的一个新分离物,也是在中国内地发现的第一个分离物,其基因组为单链环状DNA,全长为2757 nt,编码6个ORF;该病毒分离物是引起广东省番茄曲叶、叶尖白化病的病原,可被烟粉虱MEAM1隐种高效传播。

广东主要茄子品种对青枯病的抗性鉴定与评价

收集了目前在广东生产推广种植的19个茄子品种,通过室内苗期人工接种,鉴定与评价了这些茄子品种对青枯病的抗性水平,结果显示:冠军紫红茄、长优紫长茄、华育二号紫红长茄、宏运茄王、长丰二号和新丰1号紫红长茄这6个品种对茄子青枯病表现为抗病;美丰三号紫长茄、紫龙长丰Ⅲ、福将紫红长茄、紫荣6号长茄、中冠二号紫长茄、金卡龙三号紫红长茄、旭紫长茄、农丰紫红茄、农夫长茄、圣紫和特级32号这11个茄子品种对茄子青枯病表现为中抗(耐病);金穗鲜红长茄和火焰山紫红长茄这2个品种对茄子青枯病表现为感病,说明目前广东省生产上推广种植的茄子品种中绝大多数对青枯病表现为抗或中抗。

瓜类枯萎病及其综合防治技术

瓜类枯萎病是广东瓜类作物上主要病害,每年均造成较严重的经济损失。阐述了瓜类枯萎病的症状、病原特性、致病机理、病害侵染循环及发生规律,并提出了瓜类枯萎病的综合防治技术措施。

广东茄科雷尔氏菌16SrDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16SrDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%-100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1-12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458-460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2 a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.

作物青枯病研究进展

茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病是世界性、毁灭性的作物细菌病害,该病害是典型的土传病害。茄科雷尔氏菌属薄壁菌门β-变形菌纲雷尔氏菌属,为革兰氏阴性、好氧棒状杆菌,可侵染50多科200余种植物。该病原菌在无寄主植物存在时可在土壤、水体中存活5年以上,一旦有合适的寄主植物,即可通过寄主植物的根部侵染维管束系统,引起寄主植物整株性、不可逆的萎蔫枯死。茄科雷尔氏菌是一个复合种,具有明显的生理分化与遗传多样性,已发现有5个生理小种、5个生化变种、4个演化型和57个序列变种。作物青枯病在广东省多种作物上发生十分严重,是广东省重要的植物细菌病害之一。目前,至少发现有35种植物受到茄科雷尔氏菌的侵染与为害,其中桑、桉树、甘薯、沙姜、南瓜、空心菜、菊花、向日葵、广藿香、胜红蓟和人参果等作物青枯病被首次发现与报道,每年均造成巨大的经济损失。对国内外茄科雷尔氏菌及青枯病主要研究进展进行综述,并总结了本团队近20年来在青枯病研究方面取得的主要成效。

12种寄主来源的茄科雷尔氏菌16S-23S rDNA间隔区序列比较

应用PCR方法，获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心茱、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香等12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S-23SrDNA间隔区序列（ITS）。序列分析结果表明，除HZ-1菌株外，其余20个茄科雷尔氏菌菌株ITS序列长均为503bp，序列间相似性99．2％～100％，序列间差异仅1～4bp；而HZ-1菌株的ITS序列长为498bp，与其他菌株的ITS序列相似性为95．4％～95．6％。这些结果说明，这21株来源于12种不同寄主的茄科雷尔氏菌菌株的16S-23SrDNAITS序列比较保守。系统进化分析显示，仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌区组2中，其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中。

假茄科雷尔氏菌引起向日葵青枯病在中国的首次报道

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鉴定结果表明,分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌为1号生理小种和生化变种3。egl基因部分序列系统进化分析表明,15株假茄科雷尔氏菌分属4个序列变种,其中8株菌株为序列变种17,5株菌株为序列变种13,其余2株菌株分别为序列变种14和序列变种54。本文是我国首次报道假茄科雷尔氏菌侵染引起向日葵青枯病。

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,Ca CV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMo V、Chi VMV和PVMV分布广泛,PMMo V除了茂名外,Chi VMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMo V、Chi VMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMo V、Chi VMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。

侵染广东黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒及伴随卫星DNA的分子特征

从广东省表现黄脉曲叶的黄秋葵病株上分离到病毒分离物Okra06,PCR检测结果显示,该病毒属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus.基因克隆及序列分析结果表明,其基因组仅含A组分(DNA-A),全长为2 737 nt,推导编码6个开放阅读框(Open reading frame,ORF).该组分与木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leafcurl Multan virus,CLCuMV)分离物G6的核苷酸序列相似性最高,为99.7%;二者编码的6个ORF相似性分别为100%、100%、99.6%、99.8%、100%和99.7%.该病毒还伴随有卫星分子β(DNAβ),全长为1 346 nt,推导其互补链上编码1个ORF(C1).该分子与伴随CLCuMV分离物G6 DNAβ的核苷酸序列相似性也最高(99.5%).DNAβ系统进化分析显示,Okra06 DNAβ与CLCuMV-[G6]DNAβ、CLCuMV-[Gx08]DNAβ亲缘关系最近,三者形成一个独立分支;进一步与其他CLCuMV DNAβ和CLCuV DNAβ聚类在一起.这些结果证明,侵染广东黄秋葵的病毒分离物Okra06属于CLCuMV,且该分离物与引起广东朱槿曲叶病的CLCuMV-G6应同属木尔坦棉花曲叶病毒朱槿株系.

木尔坦棉花曲叶病毒及其伴随的β卫星分子复合侵染引起广东棉花曲叶病

【目的】明确引起广东棉花曲叶病的病原,为该病害的防控提供理论依据。【方法】应用PCR、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)、基因克隆及测序等技术获得病毒分离物GD01基因组及卫星分子的序列,并对序列进行分析;通过构建GD01及其β卫星分子的侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β和利用农杆菌介导的注射接种方法,测定GD01及其β卫星分子对棉花的致病性;进一步通过Southern blot检测对接种植株进行分析与验证。【结果】侵染广东棉花的病毒分离物GD01基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 737nt,且与在中国发现的木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V)第一个分离物朱槿分离物G6序列相似性为100%。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 345 nt,与G6伴随的β卫星分子(Cotton leaf curl Multan betasatellite isolate G6,CLCu Mu B-[G6])序列相似性为99.9%。构建了GD01 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β,农杆菌注射接种本氏烟,接种后15 d,二者混合接种的本氏烟植株新出的叶片表现明显的皱缩、卷曲等症状;随着时间的推移,本氏烟的症状越来越明显。农杆菌注射接种棉花,接种后30 d,二者混合接种的棉花植株新出叶片开始出现叶脉变深绿色,叶片卷曲等症状;接种后90 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为叶片向上卷曲、叶脉深绿色、叶脉肿大等典型棉花曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的棉花植株没有产生明显的症状。Southern blot检测结果显示,表现典型曲叶症状的接种棉花植株均含有GD01 DNA-A及其β卫星分子,进一步支持这些症状是由GD01 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起。【结论】病毒分离物GD01 DNA-A及其伴随的β卫星分子与入侵中国的CLCu Mu V第一个分离物朱槿分离物G6相同,CLCu Mu V-[GD01]及其伴随的CLCu Mu B-[GD01]复合侵染引起广东棉花曲叶病,利用农杆菌介导的侵染性克隆接种法,完成了CLCu Mu V及其CLCu Mu B复合侵染引起棉花曲叶病的柯赫氏法则(Koch's Postulates)。

木尔坦棉花曲叶病毒已对我国棉花生产构成严重威胁

木尔坦棉花曲叶病毒是引起巴基斯坦和印度棉花曲叶病流行的主要病原之一,是由烟粉虱以持久方式传播。近年来,在广东和广西分别发现了严重侵染朱槿和黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒。虽然广东和广西不种植棉花,但该病毒传播介体烟粉虱在广东、广西及我国棉花产区都有分布。因此该病毒的入侵,对我国棉花生产构成严重威胁。

广东苦瓜主要品种对枯萎病的抗性评价

收集了目前在广东推广种植的11个苦瓜品种,通过苗期室内人工接种,鉴定和评价了这些品种对苦瓜枯萎病的抗性水平。结果显示,绿王子油瓜、巨宝二号、海南大肉苦瓜、丰绿苦瓜和华研2号5个品种对苦瓜枯萎病表现为抗病;油绿三号、海南厚肉苦瓜F1、农得利苦瓜3个品种对苦瓜枯萎病表现为中抗(耐病);而杂交大顶103、翠绿三号和碧丰苦瓜对苦瓜枯萎病则表现为感病。说明目前广东省生产上推广种植的苦瓜品种中绝大多数对枯萎病表现为抗病或中抗水平。

侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定

在广东番茄上发现一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RT-PCR检测,结果表明,从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DNA特异片段。对其中1份样品的扩增片段进行克隆与序列分析,结果表明,扩增片段包括1个长度为1 665个核苷酸的完整病毒基因,其核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70基因有较高的同源性,表明广东番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV广东番茄分离物的HSP70序列与国内外已报道的各分离物的同源性均低于82%,存在较大差异,其中与塞浦路斯tomato、约旦JU_20分离物的同源性最高,为81.8%。这是ToCV在广东发生的首次报道,也是该病毒HSP70基因序列存在显著差异分离物的首次发现。

广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt,编码6个ORF,其中病毒链上编码AV1和AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明,4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示,广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近,并聚类在一个分支。因此,侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。

侵染广东省葫芦科作物的中国南瓜曲叶病毒的分子特征

【目的】中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)是危害葫芦科作物的主要病毒之一,可侵染南瓜、葫芦、冬瓜、黄瓜、甜瓜、哈密瓜,严重影响葫芦科作物生产。论文旨在探究SLCCNV广东分离物的分子特征、亲缘关系及其致病性,为SLCCNV的防控提供科学依据。【方法】从广东省湛江市雷州市和徐闻县、惠州市博罗县、河源市源城区以及佛山市高明区共采集53份疑似感染菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒的葫芦科作物病样,提取总DNA,利用菜豆金色黄花叶病毒属通用引物AV494/CoPR进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得各分离物基因组A组分(DNA-A)的全长序列;同时利用背向引物PCR扩增、克隆及测序,获得各分离物基因组B组分(DNA-B)的全长序列。将得到的SLCCNV广东分离物DNA-A和DNA-B全长序列在NCBI中进行BLAST分析,利用SDT1.2软件MUSCLE alignment方法对序列相似性作进一步比较分析,应用MEGA7软件对获得的SLCCNV广东分离物及已报道的SLCCNV分离物进行系统发育分析。采用同源重组技术,构建SLCCNV河源南瓜分离物的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射接种南瓜子叶,测定其致病性。【结果】PCR检测结果表明,53份疑似病样中有52份感染了菜豆金色黄花叶病毒属病毒;进一步从南瓜、葫芦、冬瓜以及白瓜4种葫芦科作物病样中分别克隆获得8个SLCCNV广东分离物基因组全序列,DNA-A组分全长大小为2735—2739 nt,含有6个ORF,与已报道SLCCNV相同。DNA-B组分大小为2701—2721 nt,含有2个ORF,分别编码与病毒运动相关的蛋白BC1和BV1。序列相似性比较结果显示,广东不同分离物DNA-A组分核苷酸序列相似性在94.9%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在88%以上;所获得的DNA-B组分核苷酸序列相似性在86.7%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在83%以上。系统发育分析结果显示,8个广东分离物与来自中国广西、河南、海南、越南、泰国、菲律宾、印度尼西亚的分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。致病性测定结果表明,接种后15 d(dpi),接种南瓜植株的新叶开始出现了皱缩症状;30 dpi,接种南瓜植株表现典型的曲叶病症状,PCR检测均为阳性,Western blot检测进一步验证了上述结果。【结论】在广东检测到SLCCNV侵染多种葫芦科作物,SLCCNV是引起广东南瓜曲叶病的病原。SLCCNV广东分离物与广西、海南等分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。

16种杀菌剂对火龙果褐腐病菌抑菌持效期及田间防效试验

【目的】筛选对火龙果褐腐病菌(Neoscytalidium dimidiatum)抑菌持效期长且田间防治效果好的杀菌剂,为火龙果生产上最具毁灭性的褐腐病防治提供科学依据。【方法】采用琼脂扩散法,通过测量和观察抑菌圈大小及消失时间测定16种杀菌剂抑制病菌生长的持效期,对其中抑菌效果好或持效期长的杀菌剂开展田间药效试验与防效比较。【结果】咯菌腈、丙环唑、丙硫菌唑、戊唑醇、氟硅唑、异菌脲等6种杀菌剂对病菌的抑菌持效期长,培养15 d后抑菌圈尚未消失;咪鲜胺、苯醚甲环唑、腈菌唑等3种杀菌剂对病菌的抑菌持效期较长;多菌灵、噻菌灵、嘧菌酯等3种杀菌剂初期对病菌的抑菌持效期较短;丙森锌、春雷霉素、百菌清、氟环唑等4种杀菌剂的抑菌持效期极短。田间药效试验显示,戊唑醇、异菌脲、氟硅唑、丙硫菌唑、丙环唑等5种杀菌剂对火龙果嫩茎具有良好的防治效果;除丙环唑在500 mg/kg施药浓度下对火龙果嫩茎生长产生抑制作用外,其余4种杀菌剂对火龙果生长安全。【结论】生产上优先推荐使用具有内吸活性的戊唑醇、异菌脲、氟硅唑、丙硫菌唑、丙环唑等药剂防治火龙果褐腐病,轮换用药;在病情压力较大的果园,施药浓度可以适当加大。

辣椒黄脉病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

辣椒黄脉病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)是影响世界辣椒生产的重要病毒,也是广东省辣椒上主要病原病毒之一。本研究根据PeVYV基因组P3蛋白基因序列设计了2对引物,建立了该病毒的反转录-环介导等温扩增(reverse transcription loop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法。该方法70min便可完成对PeVYV的检测,无需特殊的设备,灵敏度比普通RT-PCR高10倍,对田间疑似病样的检出结果与RT-PCR的结果一致。本研究建立的PeVYV RT-LAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点,适合于对PeVYV病样快速、准确检测与鉴定。