多重PCR联合毛细管电泳技术检测碳青霉烯酶基因

目的建立并评价多重PCR联合毛细管电泳技术(mPCR-CE)同时检测碳青霉烯酶基因bla_(KPC)、bla_(NDM)、bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的方法。方法设计特异性引物,建立多重PCR扩增体系,利用毛细管电泳检测扩增产物。以携带bla_(KPC)、bla_(NDM)、bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的细菌作为阳性对照菌株,以携带其他β-内酰胺酶基因细菌作为阴性对照,用于mPCR-CE的灵敏度、特异性评价。收集68株碳青霉烯耐药菌株,利用mPCR-CE方法进行检测,并与PCR扩增后测序结果比较。结果mPCR-CE检测携带bla_(KPC)、bla_(NDM)和bla_(VIM)细菌最低检测限均为1.5×10^(2) CFU/mL,检测携带bla_(OXA-48)细菌为1.5×10^(3) CFU/mL,并且与携带其他β-内酰胺酶基因的细菌无交叉反应。经mPCR-CE检测,68株临床分离菌株中37株携带bla_(KPC),8株携带bla_(NDM),未检测到携带bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的菌株,结果与PCR扩增后测序结果完全一致。结论mPCR-CE可用于临床分离菌株的主要碳青霉烯酶基因检测。

三代EGFR-TKI奥希替尼(AZD9291)耐药细胞系建立及耐药标志预测分析

目的建立三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)奥希替尼耐药细胞系(PC9-OR)并分析其耐药标志。方法浓度梯度递增构建奥希替尼耐药PC9细胞系(PC9-OR)。利用生物信息学分析AZD9291耐药细胞株表达谱芯片和测序数据筛选出耐药细胞高表达基因;荧光定量PCR验证表达;Logistics构建回归诊断模型并用ROC曲线验证其诊断效能。结果成功构建PC9-OR耐药细胞株,对3组独立PC9-OR细胞表达谱数据生物信息分析,发现19个基因表达在至少两个数据集中表达上调,3个基因在3个耐药细胞数据集表达均上调。荧光定量PCR检测PC9-OR细胞耐药相关基因有11个表达上调。Logistics回归显示5个基因诊断效能较好,ROC联合诊断模型显示曲线下面积0.985。结论构建了三代EGFR-TKI奥希替尼耐药细胞系PC9-OR,发现一组基因可以作为EGFR-TKI耐药的标志,可能为临床及时发现EGFR-TKI耐药提供依据。

检测5种碳青霉烯酶基因的多重PCR方法的建立及临床应用

目的建立并评价一种多重降落PCR(Multiplex Touchdown PCR,MT-PCR)方法检测5种碳青霉烯酶基因。方法收集东部战区总医院保存的42株耐碳青霉烯类菌株和合成的带有OXA-48部分基因质粒,建立5种碳青霉烯酶基因的多重降落PCR方法,分析其特异性、敏感性,并收集东部战区总医院临床微生物实验室送检的临床无菌体液标本67份及其分离菌株36株进行临床应用评价。结果MT-PCR可用于5种碳青霉烯酶基因的检测,对blaOXA-48、blaVIM和blaKPC检测限均为200 CFU/ml,而对blaIMP与blaNDM的检测限为2×10^3 CFU/ml。42株临床分离菌株的MT-PCR检测结果与单重PCR检测结果完全一致。以抗菌药物药敏试验为参考方法,67个无菌体液标本的MT-PCR结果与药敏试验结果差异无统计学意义(P=0.125),且敏感性和特异性分别为80.00%和100.00%。结论MT-PCR方法能有效地用于临床分离物和无菌体液标本中的碳青霉烯酶基因检测。