微小扇头蜱microRNA文库建立及miR-275靶蛋白Vg-2的生物信息学分析

【目的】建立饱血状态雌性微小扇头蜱的microRNA文库,鉴定所含microRNA的种类,分析miR-275靶蛋白Vg-2的二、三级结构,检测其信号肽、跨膜结构域、磷酸化及糖基化位点,预测其优势抗原表位。【方法】以雌性、饱血状态的微小扇头蜱为研究对象,通过高通量测序技术建立其microRNA文库,利用软件miRDP及检索miRBase数据库,鉴定饱血状态雌性微小扇头蜱所含的microRNA种类;运用在线软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL等分析Vg-2蛋白质理化性质,推断其二、三级结构;运用在线软件SignalP 5.0、TMHMM、NetPhos 3.1及NETCGlyc 1.0检测该蛋白的信号肽、跨膜结构域、磷酸化与糖基化位点;利用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL预测Vg-2蛋白的B、T细胞优势抗原表位。【结果】获得成熟的microRNA 383个,其中67个为已被鉴定和注释的microRNA,316个为新发现的microRNA;微小扇头蜱的Vg-2基因序列全长5040 bp,共编码1679个氨基酸;Vg-2蛋白为亲水性酸蛋白,分子大小为189.89 kDa,理论等电点(pI)为6.08,其二级结构以无规则卷曲为主要结构成分,而其三级结构却以β-折叠为主要结构成分;Vg-2蛋白存在268个磷酸位点,20个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域,拥有58个B细胞优势抗原表位和8个T细胞优势抗原表位。【结论】在饱血状态雌性微小扇头蜱体内含有383个microRNA,受miR-275调控的Vg-2蛋白为结构不稳定的亲水性酸蛋白,具有良好的抗原性与免疫源性。

不同种群白纹伊蚊单倍型多态性、遗传分化及种系发育关系分析

【目的】试验旨在探究湖南怀化地区不同种群白纹伊蚊单倍型多态性、遗传分化情况及种系发育关系。【方法】于湖南怀化地区采集30只白纹伊蚊样本,PCR扩增其核糖体18S rRNA及线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)基因部分序列。利用ClustalX软件对其变异位点进行分析;运用Dnasp 5.0、Network 4.6及Arlequin version 3.0软件进行单倍型多态性与遗传分化分析;利用PhyML 3.0及Mega 5.0软件对白纹伊蚊的种系发育关系进行分析。【结果】所获全部样本的18S rRNA和cox 1基因序列长度均为489和1004 bp。白纹伊蚊18S rRNA基因序列中共存在30个变异位点,17个单倍型(A1~A17,Hd=0.9149),其中单倍型A5为最古老的单倍型,白纹伊蚊18S rRNA的基因分化系数(Gst)、遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)分别为0.05614、0.24001和0.792;白纹伊蚊的cox 1基因序列中共存在2个变异位点,3个单倍型(B1~B3,Hd=0.1908),其中单倍型B1为最古老的单倍型,白纹伊蚊cox 1基因的Gst、Fst和Nm分别为0.05000、0.04762和4.999。系统发育树中,来源于怀化地区的30只白纹伊蚊均分别处于2个发育树的一个分支。【结论】来源于湖南怀化地区的白纹伊蚊个体和种群之间存在一定程度基因变异和单倍型多态性现象,但各单倍型及其个体之间具有较近的亲缘关系,且两种群白纹伊蚊个体间发生了较为频繁的基因交流,未出现遗传分化。

不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系分析

为了探究不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系,本试验以采自于湖南、河南两省的褐黄血蜱(各10只,共20只)为研究对象,通过PCR扩增其细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cox1)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ(nad4)基因序列,对其单倍型多态性(Hd)、遗传分化和种系发育关系进行分析。结果显示,cox 1基因序列(849 bp)包含4个变异位点,5个单倍型(h=5,A1~A5,Hd=0.653),其基因分化系数(Gst)=0.061,遗传分化系数(Fst)=-0.047,基因流(Nm)=-5.625;nad 4基因序列(626 bp)包含3个变异位点,3个单倍型(h=3,B1~B3,Hd=0.363),其Gst=0.004,Fst=0.074,Nm=3.125;cox 1+nad 4基因序列包含7个变异位点,7个单倍型(h=7,C1~C7,Hd=0.768),其Gst=-0.010,Fst=-0.015,Nm=-16.560;在所构建的种系发育树中,20只褐黄血蜱均处于种系发育树的一个分支。结果表明,湖南、河南两省的褐黄血蜱个体之间虽表现出单倍型多态性,但它们之间具有较近的亲缘关系,尚未出现遗传分化。

猪圆环病毒2型Cap蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a(+)中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。

基于ITS基因分析扩展莫尼茨绦虫种系发育关系

为研究扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列的遗传变异情况,并利用ITS序列探讨扩展莫尼茨绦虫与其它带科绦虫的种群发育关系,本研究利用PCR对扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列进行扩增、测序及分析。结果表明:16株扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列长度一致,为1462~1473bP,且分离株与基因库扩展莫尼茨绦虫位于同一大分支,可以与其它带科绦虫有效鉴别。说明ITS序列种内较为保守,种间差异较大,可以作为扩展莫尼茨绦虫的种间遗传变异研究的分子标记。

不同饱血状态草原革蜱与森林革蜱中肠菌群结构的对比与分析

为探明草原革蜱和森林革蜱不同饱血状态下中肠菌群结构的特点,本研究在无菌条件下分别采集饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rRNA V3区,变性梯度凝胶电泳(DGGE)后,切取优势条带纯化、克隆和测序,测序结果与GenBank数据库中已知细菌序列进行比对分析。结果显示,在饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠4个肠内容物样品中共检测到巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、大肠杆菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体5种细菌,其中半饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和大肠杆菌;饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和嗜吞噬细胞无形体;半饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、大肠杆菌和嗜吞噬细胞无形体;饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体;4个样品中的共有菌为巴氏立克次体暂定种。研究结果表明,不同蜱种中肠内菌群的结构随吸血时间的延长而发生变化。本研究将为防治草原革蜱、森林革蜱及相关蜱传病提供科学依据。

猪结肠小袋纤毛虫病的诊断与防治

猪结肠小袋纤毛虫病是由结肠小袋纤毛虫寄生于猪结肠所引起的一类人畜共患原虫病。该病主要引起断奶仔猪表现出腹泻、脱水、消瘦及贫血等特征性的一系列临床症状。为了有效的防治以腹泻、脱水和消瘦为特征的猪结肠小袋纤毛虫病。根据临床症状、剖解所见的病理变化作出初步诊断。此外,采取分子生物学(PCR技术)方法对该病作出确诊,确诊该病病原为猪结肠小袋纤毛虫。针对该病原体的特性,我们采用甲硝唑+驱虫净配伍方式对病猪进行治疗。结果显示大部分病猪痊愈,治愈率为99.2%。

芷江鸭消化道寄生虫感染情况调查

为了解芷江县鸭寄生虫种类以及寄生虫病流行特点,为寄生虫病防治提供一定的依据和参考。文章采用完全蠕虫学剖检和粪便检查两种方法,对芷江县的小河口、吴家垄、麻英塘、公平、蟒塘溪、冷水溪六个鸭场不同日龄雏鸭、成鸭共计120只进行寄生虫病学检查。结果显示:被调查地区鸭群寄生虫感染率较高,多数存在复合感染,其感染主要以吸虫和绦虫为主,吸虫、绦虫、线虫感染率分别为68.33%、70%、41.7%。

基于prrnS基因序列分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系

为研究湖南省黑斑蛙裂头蚴分离株的核糖体(rDNA)小亚基基因(rrnS)部分序列(prrnS)的遗传变异情况,并用所获得prrnS序列构建黑斑蛙裂头蚴与其他绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增湖南省黑斑蛙裂头蚴的prrnS,将PCR产物进行测序并对其序列进行分析。9株湖南省黑斑蛙裂头蚴分离株的prrnS序列长度均一致,为330 bp。经分析显示,黑斑蛙裂头蚴prrnS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为蛙裂头蚴的种间遗传变异研究的分子遗传标记。

一例疑似猪伪狂犬病的诊断与分析

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病毒(PRV)感染引起的一种重要的传染病,可导致怀孕母猪流产、死胎,仔猪腹泻、呕吐和神经症状等,给我国养猪业造成巨大的经济损失。2019年4月初,怀化市某散养场从外地购入的仔猪爆发疑似PR的疫情,通过临床症状和病理变化观察,结合实验室诊断,发病仔猪确诊为PRV感染。PCR及测序结果表明,引起该次疫情的PRV毒株,其gE基因序列与Genbank收录的PRV中国流行的河南株同源性最高,为99.7%,提示该毒株为变异株。通过对发病猪群紧急免疫PRV基因缺失弱毒疫苗有效地控制了该病的发生,研究对PR的诊断与防控提供借鉴。

二例犬焦虫病的诊治

犬焦虫病是以蜱为传播媒介,由巴贝斯虫寄生在宿主的红细胞内引起的一种以发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿为特征的寄生虫病。主要发生于蜱虫活动的季节,一般只在有蜱滋生的地区呈地方性流行,本病不仅因病程较短,死亡率高而给养犬业带来重大损失,而且它作为一种新出现的人畜共患病而逐渐引起人们的关注。本文报告了两例犬焦虫病的诊断和治疗过程,并重点讨论了犬焦虫病临床鉴别诊断,输血疗法的运用和作用及犬焦虫病的痊愈标准等问题。

一例猪疥螨病诊断与防制

猪疥螨病由疥螨寄生于猪皮肤表面所引发的慢性寄生虫病,导致猪群患部发痒、脱毛和体质消瘦等,该病也感染人,对人畜健康造成巨大的危害。由于该病是慢性寄生虫病,对猪群不易致死,导致养殖户容易忽视对猪疥螨病的防控,使该病在猪场广泛流行。2018年7月,笔者接诊怀化市某规模化猪场猪疥螨病案例,通过对发病猪群进行临床诊断和实验室诊断,最终确诊为猪疥螨病感染,将其诊治过程简要阐述,旨在为该病的防控提供参考。

一例犬冠状病毒病诊断与治疗

犬冠状病毒病是由犬冠状病毒引起的一种多发性、急性、以胃肠道炎症为主要症状的高度接触性传染病,以呕吐、腹泻、脱水及易复发为特性。该病对幼犬危害尤其严重,病死率很高,是目前对养犬业危害较大的疾病之一。尽管近年来国内外对犬冠状病毒病的研究取得了不少进展,但目前本病还没有特效的药物及其疗法可以治疗本病,临床上主要采取一般性的综合措施。本研究以就近诊断一例犬冠状病毒病例为基础,通过对该病的临床症状、诊断过程及疾病治疗过程进行阐述,为临床上犬冠状病毒病的诊断、治疗及准确的预后判断等提供一定的参考资料。

奶牛结核病的诊断与防制

奶牛结核病为重要的人畜共患的慢性传染病,该病可导致患病奶牛出现肺结核、肠结核和淋巴结核等多种疾病,相关临床症状与发病部位有关,为二类动物疫病,对人畜健康威胁巨大。本文介绍了奶牛结核病流行特点、临床症状,病理变化和诊断防控措施,为养殖户对该病的防制提供参考。

一例猪弓形虫病的诊治与防控

弓形虫病由刚地弓形虫感猪弓形虫病为重要的人畜共患性寄生虫病,不但对我国生猪养殖业造成巨大经济损失,还对养殖户和消费者健康造成潜在威胁。该病可导致母猪流产、死胎,但容易被养殖户忽视,使疫病导致的经济损失加剧。为提高养殖户对该病的防控意识,笔者以近期诊断的一例猪弓形虫病为例,对其临床诊断过程和防控措施进行简要阐述,为养殖户对该病的防控提供参考依据。

一例魏氏梭菌感染仔猪的诊断与防控

魏氏梭菌可感染多种动物,其中包括人类、猪、牛和羊等哺乳动物,是一种常见的可引起仔猪腹泻的肠道菌病原体。该病原体有5个血清型,分别为A、B、C、D和E血清型,其中引发严重临床症状和病死率的血清型主要是A和C型[1]。猪群感染该病后可出现明显的临床症状,不同生长阶段猪群感染该病所出现的临床症状存在较大的差异,其中以仔猪发病最为明显,可出现血痢,且病猪在短时间内死亡,给养殖户造成难以挽回的损失[2]。近期,怀化市某养殖场仔猪群暴发腹泻病,临床以血痢为主,且出现较高的病死率,结合该病的发病特点和诊断结果,最终确诊为魏氏梭菌感染引起的,其诊断及防控过程如下。

怀化市某猪场仔猪破伤风的诊断与治疗

破伤风梭菌为重要的人畜共患性病原,感染仔猪可导致病畜出现破伤风,其临床主要表现为全身性肌肉痉挛和极度兴奋,甚至导致急性死亡。随着饲养管理水平的提高,该病在猪场中较为少见,导致养殖户对其防控意识差。2019年10月初,怀化市某散养场部分初生仔猪突然发病,且死亡率极高,通过对该病进行临床与实验室技术诊断,最终确诊为破伤风杆菌感染引起,经过紧急治疗,部分发病仔猪康复,减少了养殖户的经济损失。

鸡蛔虫COX2和NAD4rDNA的序列测定及分析

本试验旨在阐明湖南省鸡蛔虫分离株线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅱ亚基(cox2)基因部分序列(pcox2)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位IV基因(nad4)部分序列(pnad4)的遗传变异情况。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增鸡蛔虫的pcox2and pnad4,应用clustalx1.81程序对序列进行比对,结果显示,所获得的cox2(pcox2)and nad4(pnad4)序列长度一致,为350bp(pcox2)and 400bp(pnad4)。由于鸡蛔虫pcox2and pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为鸡蛔虫的分类鉴定及进一步的分子流行病学调查提供了基础。

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.

大肠杆菌野生株F18菌毛蛋白粘附亚单位基因的克隆与表达

根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.